Bevacizumab(Avastin)抑制兔眼角膜新生血管的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、角膜新生血管（corneal neovascularization,CNV）是目前全球范圍內(nèi)主要的致盲眼病之一，也是角膜移植排斥反應(yīng)發(fā)生的高危因素。對(duì)CNV發(fā)生機(jī)制及其防治措施的研究一直以來(lái)都是眼科學(xué)界的一個(gè)熱點(diǎn)，迄今為止，CNV的發(fā)生機(jī)制尚未完全清楚。目前認(rèn)為，CNV的發(fā)生與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）密切相關(guān)，它被認(rèn)為能特異性地促進(jìn)血管內(nèi)皮分裂、增殖及遷移，是公認(rèn)

2、血管生成的中心調(diào)節(jié)者，也是目前所發(fā)現(xiàn)的最有力的促血管形成因子之一。Bevacizumab(Avastin) 是一種抗 VEGF人源化單克隆抗體,可以同所有已知VEGF異構(gòu)體結(jié)合,通過(guò)抑制其生物學(xué)活性間接阻斷 VEGF和其受體的結(jié)合而阻止血管滲漏和新生血管的形成。近幾年，由于其對(duì)血管源性眼病,特別是對(duì)新生血管性 AMD(老年性黃斑變性)的良好療效,成為目前世界眼科學(xué)界的關(guān)注焦點(diǎn)。為了觀察其對(duì)角膜新生血管的治療作用，我們以基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)方法制造兔

3、眼角膜CNV模型，Bevacizumab(Avastin)球結(jié)膜下注射干預(yù)治療，觀察CNV的生長(zhǎng)和角膜組織及房水中VEGF的表達(dá)情況，為臨床治療角膜新生血管提供理論依據(jù)和新的思路。我們的研究分為兩個(gè)部分。 第一部分、角膜新生血管模型的制作 目的：制作經(jīng)濟(jì)穩(wěn)定重復(fù)性好的兔眼角膜新生血管模型。 方法：新西蘭大白兔6只，選左眼為實(shí)驗(yàn)眼，隨機(jī)分為2組，A組為角膜堿燒傷組，采用1mol/L 氫氧化鈉（NaOH），8mm的濾

4、紙片浸潤(rùn)，燒灼時(shí)間為1min；B組為角膜縫線組，用6/0絲線在角膜4個(gè)象限分別間斷縫合，縫線深度約2/3角膜厚度，縫線穿過(guò)角膜基質(zhì)層的長(zhǎng)度約3.0ｍｍ。術(shù)后每日在手術(shù)顯微鏡下觀察兔眼角膜混濁，角膜潰瘍，CNV生長(zhǎng)情況并于術(shù)后14d計(jì)算其面積。 結(jié)果：A組兔角膜NaOH燒傷后，1d角膜混濁明顯，中央少量潰瘍，角膜緣血管充血明顯，2只兔于7d時(shí)角膜緣出現(xiàn)CNV芽，1只兔于10d出現(xiàn)，14d平均CNV面積14.92±7.46 mm2。

5、B組兔角膜6/0絲線板層縫合后2d，3只兔均可見(jiàn)角膜緣血管環(huán)充血擴(kuò)張，CNV芽呈細(xì)小毛刷狀長(zhǎng)入透明的角膜，整齊而密集；7d時(shí)均見(jiàn)CNV生長(zhǎng)，14dCNV密集，管徑粗大，色鮮紅,平均CNV面積34.77±4.09 mm2。角膜未見(jiàn)混濁和潰瘍。統(tǒng)計(jì)分析后B組CNV面積顯著大于A組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。B組變異系數(shù)（16.73％）小于A組（55.58％）。 結(jié)論：NaOH堿燒傷和角膜縫線法都能制作兔眼CNV模型，縫線法相

6、對(duì)穩(wěn)定重復(fù)性好。 第二部分、Bevacizumab(Avastin)抑制兔眼角膜新生血管的實(shí)驗(yàn)研究 目的：觀察Bevacizumab(Avastin)球結(jié)膜下注射對(duì)角膜縫線誘導(dǎo)兔眼新生血管的治療作用。 方法：新西蘭大白兔48只，隨機(jī)分為正常對(duì)照組（A組3只）、實(shí)驗(yàn)對(duì)照組（B組9只）和實(shí)驗(yàn)組(C組36只)，C組又分為四組：1天小劑量治療組（C1組9只）和1天大劑量治療組（C2組9只），14天小劑量治療組（C3組9只

7、）和 14天大劑量治療組（C4組9只）。建模方法為：手術(shù)顯微鏡下，兔左眼用6-0絲線在角膜4個(gè)象限分別間斷縫合，縫線深度約2/3角膜厚度，縫線穿過(guò)角膜基質(zhì)層的長(zhǎng)度約3.0ｍｍ，制備角膜新生血管（Corneal Neovascularization,CNV）動(dòng)物模型。A組為正常對(duì)照組，既不縫線也不治療。動(dòng)物模型制備后第１d，在Ｃ１和Ｃ２組兔眼球結(jié)膜下分別注射Bevacizumab(Avastin)0.1ml和0.2ml；第１４d在B組兔眼

8、球結(jié)膜下注射生理鹽水0.2ml；在Ｃ３和Ｃ４組兔眼球結(jié)膜下分別注射Bevacizumab(Avastin)0.1ml和0.2ml。術(shù)后每日在手術(shù)顯微鏡下觀察兔眼角膜CNV生長(zhǎng)情況并計(jì)算其面積，且于建模后7，14，28d分別拍照記錄，用免疫組化方法檢測(cè)各組角膜組織中VEGF的表達(dá)情況，酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（ELISA） 檢測(cè)房水內(nèi)VEGF含量。 結(jié)果：將各組的 CNV生長(zhǎng)情況及角膜組織炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)程度比較后發(fā)現(xiàn)：在7d，14d，28

9、dＣ1和Ｃ2組均較Ｂ組明顯減輕（P<0.01），28d時(shí)C3組CNV和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)程度較B組明顯減輕（P=0.006<0.01），C4組較B組明顯減輕（P=0.002<0.01）；28d時(shí)C1組較C3組明顯減輕（P<0.01）,C2組較C4組明顯減輕（P<0.01）。角膜免疫組織化學(xué)染色后發(fā)現(xiàn)：角膜組織中VEGF主要定位于上皮細(xì)胞、基質(zhì)纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、浸潤(rùn)的炎癥細(xì)胞及新生血管內(nèi)皮細(xì)胞胞質(zhì)中。B組角膜組織中VEGF表達(dá)的陽(yáng)性率隨時(shí)間推

10、移逐漸增高，且表達(dá)強(qiáng)度與CNV面積的大小具有正相關(guān)(r=0.923，P<0.01)。角膜VEGF的表達(dá)在縫線后7d，14d，28d時(shí)C1和C2組均低于B組（P<0.05），28d時(shí) C3和 C4組也均低于B組（P＝0.034<0.05）；28d時(shí)角膜VEGF的表達(dá) C1組低于C3組（P＝0.025<0.05），C2組低于C4組（P＝0.034<0.05）。兔眼房水ELISA分析后發(fā)現(xiàn)：B組房水中 VEGF的含量隨著時(shí)間的推移逐漸增長(zhǎng)，在

11、縫線后7d，14d，28d均高于正常對(duì)照組（A組），并且房水中VEGF的濃度與角膜組織中VEGF表達(dá)和CNV面積呈正相關(guān)。房水VEGF濃度在C1,C2組用藥后7d，14d，28d均低于B組（P<0.01），28d時(shí)C3，C4組均低于B組（P<0.01）。28d房水VEGF的濃度C1組低于C3組（Ｐ＝0.009<0.01），C2組低于C4組（Ｐ＝0.006<0.01）。C1和C2組之間以及C3和C4組之間在CNV面積，角膜和房水中VEGF