新型地塞米松-Avastin超分子水凝膠抑制角膜新生血管的研究.pdf

1、目的：制備一種新型的地塞米松-Avastin超分子水凝膠，在明確理化性質(zhì)及眼部生物相容性的基礎(chǔ)上，觀察其對(duì)角膜新生血管（corneal neovascularization，CNV）的抑制作用及機(jī)制，為眼前段的藥物傳遞及CNV的臨床治療提供一種新的途徑。
　　方法：⑴以α-環(huán)糊精（α-cyclodextrin，α-CD）為主體與甲氧基聚乙二醇-聚己內(nèi)酯（Methoxy polyethylene glycol-poly（ε-capr

2、olactone），MPEG-PCL）雙親性嵌段共聚物膠束自組裝形成超分子水凝膠，并包載地塞米松磷酸（Dexamethasone Sodium Phosphate，Dexp）及Avastin（Ava）。掃描電子顯微鏡觀察水凝膠內(nèi)部結(jié)構(gòu)；流變及紅外光譜研究了藥物對(duì)水凝膠結(jié)構(gòu)及表征的影響；藥物體外釋放實(shí)驗(yàn)研究超分子水凝膠分別對(duì)Dexp及Ava的緩控釋效果。⑵CCK8法檢測(cè)Dexp-Ava超分子水凝膠中的載體及藥物對(duì)角膜上皮細(xì)胞（Human

3、Corneal Epithelial Cells，HCEC）的毒副作用；細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)觀察Dexp-Ava超分子水凝膠對(duì)HCECs遷移能力的影響；改良的德雷茲染眼試驗(yàn)（Draize test）了解超分子水凝膠載體在活體眼前段的生物相容性。⑶建立堿燒傷誘導(dǎo)的大鼠CNV模型，分別使用Dexp-Ava超分子水凝膠、單一藥物超分子水凝膠及單一藥物滴眼液局部點(diǎn)眼治療重度角膜堿燒傷。在燒傷第3日行炎癥指數(shù)評(píng)估；燒傷第7日及14日行CNV面積測(cè)算，燒傷

4、第3日及14日取大鼠眼球行HE染色觀察組織結(jié)構(gòu)及免疫熒光法檢測(cè)各組角膜中CD31、VEGF、α-SMA的表達(dá)；燒傷第7日取大鼠角膜行Western Blot檢測(cè)VEGF的表達(dá)。此外，還通過(guò)Cy3標(biāo)記的驢抗人IgG標(biāo)記Ava,用免疫熒光法檢測(cè)Dexp-Ava超分子水凝膠、Ava超分子水凝膠組及Ava液組不同時(shí)間點(diǎn)Ava在角膜的分布。
　　結(jié)果：①掃描電子顯微鏡顯示Dexp-Ava超分子水凝膠具有三維立體結(jié)構(gòu)，并具有典型的膠束超分子水

5、凝膠疏松多孔的特征。傅里葉紅外光譜檢測(cè)空白超分子水凝膠、Dexp超分子水凝膠、Ava超分子水凝膠及Dexp-Ava超分子水凝膠凍干粉末所得紅外圖譜，對(duì)比空白超分子水凝膠和包載藥物超分子水凝膠的結(jié)果，可見(jiàn)沒(méi)有新的吸收峰出現(xiàn)。流變學(xué)檢測(cè)結(jié)果示在體表溫度下（37℃），各組超分子水凝膠的儲(chǔ)能模量（G’）始終大于耗損模量（G”）；在頻率發(fā)生變化時(shí)，各組儲(chǔ)能模量（G’）始終大于耗損模量（G”），存儲(chǔ)模量（G’）及損耗模量（G”）并未隨頻率的變化而變

6、化。根據(jù) ELISA及HPLC結(jié)果， Dexp-Ava超分子水凝膠中的Ava及Dexp檢測(cè)到的釋放量均達(dá)到70％以上，體外釋放早期Dexp有突釋現(xiàn)象，而Ava持續(xù)緩慢釋放。②CCK8檢測(cè)結(jié)果示：空白超分子水凝膠載體濃度達(dá)到20mg/ml時(shí)，細(xì)胞存活率仍達(dá)85%以上，且細(xì)胞存活率并未隨載體濃度升高而下降；Ava濃度達(dá)到6.25mg/ml及Dexp到達(dá)5mg/ml時(shí)，細(xì)胞存活率仍達(dá)70%以上。角膜劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果示各組角膜上皮細(xì)胞遷移率與對(duì)照組

7、相比無(wú)明顯差異（p＞0.05）。Draize test結(jié)果示：裂隙燈檢查未見(jiàn)眼前段明顯刺激癥狀；角膜熒光素鈉染色示角膜上皮無(wú)明顯缺損；HE染色角膜各層形態(tài)結(jié)構(gòu)正常。③Dexp-Ava超分子水凝膠組炎癥指數(shù)明顯低于Ava超分子水凝膠及Ava液組（p＜0.001， p＜0.001），與Dexp超分子水凝膠組及Dexp液組相比，差異也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p=0.033， p=0.004）；Dexp-Ava超分子水凝膠組與Ava液及Dexp液組相比

8、，CNV面積均有顯著差異（p＜0.001，p＜0.001），與Ava超分子水凝膠組相比，CNV面積差異亦具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p=0.008）；HE染色結(jié)果示角膜堿燒傷后第3日Dexp-Ava超分子水凝膠的炎癥反應(yīng)及14日的CNV生長(zhǎng)程度均好于其他各治療組。免疫熒光結(jié)果示Dexp-Ava超分子水凝膠組較其他組更有效地抑制了VEGF和CD31的表達(dá)，未見(jiàn)α-SMA表達(dá)。Western Blot結(jié)果示各超分子水凝膠組均較滴眼液組能夠使藥物更有效地

9、抑制VEGF的表達(dá)。另外，Cy3標(biāo)記的驢抗人 IgG標(biāo)記Ava，不同時(shí)間點(diǎn)行角膜免疫熒光檢測(cè)，結(jié)果示隨著時(shí)間推移，Ava液組熒光迅速減弱，2h時(shí)已與陰性對(duì)照組無(wú)明顯差異。而Dexp-Ava超分子水凝膠組及Ava超分子水凝膠組在24h時(shí)在角膜淺基質(zhì)層仍可見(jiàn)較強(qiáng)熒光。
　　結(jié)論：⑴Dexp-Ava超分子水凝膠的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，可在一定程度上對(duì)抗淚液沖刷及鼻淚管的引流，延長(zhǎng)眼表滯留時(shí)間，同時(shí)在眨眼的剪切作用下可促進(jìn)藥物釋放；包裹于水凝

10、膠內(nèi)的藥物結(jié)構(gòu)及活性不受載體的影響；隨著超分子水凝膠網(wǎng)絡(luò)降解破壞的過(guò)程，水凝膠中的Dexp和Ava緩慢而可控地釋放。⑵Dexp-Ava超分子水凝膠對(duì)HCECs無(wú)毒副作用，對(duì)HCECs遷移能力無(wú)影響；MPEG5000-PCL5000與α-CD形成的超分子水凝膠藥物載體應(yīng)用于眼表時(shí)，在眼前段具有良好的生物相容性，是較為安全的眼部藥物傳遞系統(tǒng)。⑶Dexp-Ava超分子水凝膠組在角膜急性炎癥期抑制炎癥效果在各治療組中最佳；Ava超分子水凝膠組及