IL-6對(duì)肝癌患者CIK細(xì)胞增殖能力和功能的影響.pdf

1、目的：細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(Cytokine-induced killer cells,CIK細(xì)胞)是在體外由多種細(xì)胞因子誘導(dǎo)外周血單個(gè)核細(xì)胞(Peripheral blood mononuclearcell,PBMC)而生成的一群異質(zhì)細(xì)胞。CIK細(xì)胞增殖速度快，殺瘤譜廣，已經(jīng)成為過(guò)繼細(xì)胞免疫治療的主要方法之一。CIK細(xì)胞可清除腫瘤患者體內(nèi)的微轉(zhuǎn)移灶，減少術(shù)后的復(fù)發(fā)率，因此，提高CIK細(xì)胞療效對(duì)腫瘤患者的治療有著重要意義。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞

2、(Regulatory T cell，Treg細(xì)胞)是具有免疫負(fù)調(diào)節(jié)作用的T細(xì)胞亞群之一，可抑制免疫活性細(xì)胞的活化和增殖，是影響細(xì)胞免疫治療的一個(gè)因素。Treg細(xì)胞可抑制肺癌患者、胰腺癌患者CIK細(xì)胞的抗腫瘤能力，而對(duì)肝癌患者CIK細(xì)胞療效的影響目前尚未見(jiàn)報(bào)道。IL-6是一種多功能的細(xì)胞因子，有研究表明可降低Treg細(xì)胞水平。目前，臨床中獲取足量的免疫活性細(xì)胞存在困難，而IL-6可作為T細(xì)胞的第二刺激信號(hào)增加T細(xì)胞增殖的能力。本研究主要

3、探討IL-6對(duì)CIK細(xì)胞在體外增殖能力、細(xì)胞因子分泌功能和殺傷靶細(xì)胞功能的影響，為進(jìn)一步提高CIK細(xì)胞的治療效果提供參考。
　　 方法：⑴CIK細(xì)胞的體外制備：采取外周血單個(gè)核細(xì)胞，第一天加入IFN-γ，第二天加入IL-2、IL-1α、CD3McAb多種細(xì)胞因子，為CIK組即對(duì)照組；第一天加入IFN-γ、IL-6，第二天加入IL-2、IL-1α、CD3MeAb多種細(xì)胞因子，為IL-6-CIK組即實(shí)驗(yàn)組。以后根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)情況換新鮮

4、培養(yǎng)液，對(duì)照組同時(shí)加入IL-2，而實(shí)驗(yàn)組同時(shí)加入IL-2和IL-6，在體外培養(yǎng)14天。⑵CIK細(xì)胞的表型特性和細(xì)胞因子分泌：在CIK細(xì)胞培養(yǎng)的第14天，用流式細(xì)胞儀對(duì)CIK細(xì)胞進(jìn)行表型特征的分析和檢測(cè)細(xì)胞因子IFN-γ、IL-17的分泌情況。⑶CIK細(xì)胞體外殺傷活性：在CIK細(xì)胞培養(yǎng)的第14天，以肝癌細(xì)胞系7721為靶細(xì)胞，用LDH酶釋放法檢測(cè)CIK細(xì)胞對(duì)肝癌細(xì)胞的體外殺傷能力。⑷CIK細(xì)胞的增殖能力：在CIK細(xì)胞培養(yǎng)的第7天，用流式細(xì)

5、胞儀檢測(cè)CFSE標(biāo)記的CIK細(xì)胞的增殖反應(yīng)。
　　 結(jié)果：①在CIK細(xì)胞培養(yǎng)的第14天，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)其表型分布情況。結(jié)果顯示：與PBMC相比，CIK細(xì)胞中CD3+細(xì)胞的比例升高，由培養(yǎng)前的61.11±11.01上升到91.89±.2.76，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)。與PBMC相比，CIK細(xì)胞中CD3+CD4+細(xì)胞的比例降低，由培養(yǎng)前的29.33±6.45下降到13.93±8.57，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)

6、。CD3+CD8+細(xì)胞的比例由培養(yǎng)前的14.97±7.64上升到61.90±13.57，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)。CD3+CD56+細(xì)胞的比例與PBMC相比明顯升高，其值分別為8.25±4.09和3.53±2.48，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)。與PBMC相比，CIK細(xì)胞中Th17/CD4+細(xì)胞的比例升高，由培養(yǎng)前的0.87±0.47上升到2.12±1.31，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)。與PBMC相比，CIK細(xì)胞

7、中Treg/CD4+細(xì)胞的比例降低，由培養(yǎng)前的9.09±2.087下降到6.20±2.85，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)。②在CIK細(xì)胞培養(yǎng)的第14天，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)其表型分布情況。結(jié)果顯示：IL-6-CIK組與CIK組中CD3+CD4+細(xì)胞的比例分別為15.29±9.06和13.93±8.57，前者的比例高于后者，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。IL-6-CIK組與CIK組中CD3+CD8+細(xì)胞的比例分別為53.24±14.

8、16和61.90±13.57，前者的比例低于后者，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)。IL-6-CIK組與CIK組中Treg/CD4+細(xì)胞的比例分別為4.65±1.83和6.20±2.85，前者的比例低于后者，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。③CIK細(xì)胞培養(yǎng)的第7天，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)CFSE標(biāo)記的CIK細(xì)胞，結(jié)果顯示：CIK組的增殖能力：79.07±8.14％，而IL-6-CIK組的增殖能力：85.51±5.44％，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

9、P＜0.001)。④在培養(yǎng)的第14天，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)CIK細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子的分泌。結(jié)果顯示：PBMC和CIK組細(xì)胞中IFN-γ+細(xì)胞的比例分別為18.56±9.96、53.05±12.16，后者高于前者，兩者差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)。CIK組與IL-6-CIK組中IFN-γ+細(xì)胞的比例為53.05±12.16、49.26±10.17，前者高于后者，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)。⑤在CIK細(xì)胞培養(yǎng)的第14天，用LDH酶釋放

10、法檢測(cè)其對(duì)肝癌細(xì)胞的體外殺傷能力。結(jié)果顯示：與PBMC對(duì)照相比較，CIK組在體外對(duì)肝癌細(xì)胞系7721的殺傷能力增強(qiáng)(P＜0.001)。與CIK組相比，IL-6-CIK組在靶效細(xì)胞比為60∶1、30∶1、10∶1時(shí)對(duì)肝癌細(xì)胞癌7721的殺傷能力明顯提高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001、P=0
　　 結(jié)論：⑴與PBMC相比，CIK細(xì)胞中Treg/CD4+細(xì)胞的比例降低，而Th17/CD4+細(xì)胞的比例升高；⑵IL-6可提高CIK細(xì)胞