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1、背景和目的:樹(shù)突狀細(xì)胞(DC)是迄今最為重要的專(zhuān)職抗原提呈細(xì)胞,它與其它抗原提呈細(xì)胞的最大區(qū)別在于它能使初始T細(xì)胞致敏。此外,DC也參與固有免疫應(yīng)答。因此,DC在固有免疫和適應(yīng)性免疫之間起著重要的橋梁作用。RA即維甲酸,是維生素A在胞內(nèi)氧化代謝產(chǎn)生的活性衍生物,具有廣泛免疫調(diào)節(jié)作用。IL-5是由活化T細(xì)胞及肥大細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子,它能促進(jìn)嗜酸性粒細(xì)胞的增殖分化,也能促進(jìn)B細(xì)胞的分化及IgA的產(chǎn)生。IL-6是由單核-巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞分泌,
2、它能促進(jìn)T、B細(xì)胞的增殖分化,并且在IgA產(chǎn)生中起著重要作用。近年來(lái),腸道DC功能研究是免疫學(xué)研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一,報(bào)道了很多具有重要價(jià)值的發(fā)現(xiàn),如腸道DC參與腸道T和B淋巴細(xì)胞的歸巢,參與胸腺外Treg誘導(dǎo)生成,參與腸道免疫耐受以及一些腸道自身免疫性疾病的發(fā)病機(jī)制。最近,Mora等發(fā)現(xiàn)腸相關(guān)淋巴組織DC能表達(dá)RA,誘導(dǎo)腸道活化B細(xì)胞表達(dá)小腸歸巢受體,從而使抗原激活的B細(xì)胞向小腸黏膜固有層歸巢,并分化為漿細(xì)胞及分泌IgA抗體;腸外組織來(lái)源
3、的DC不產(chǎn)生RA,所以無(wú)此功能。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí),相比其它來(lái)源DC,MLN-DC或PP-DC顯著促進(jìn)活化B細(xì)胞分泌IgA抗體,并且不需要T細(xì)胞輔助或其它因素。MLN-DC或PP-DC促進(jìn)IgA產(chǎn)生的作用不是通過(guò)擴(kuò)增已經(jīng)過(guò)IgA類(lèi)型轉(zhuǎn)換的B細(xì)胞實(shí)現(xiàn)的,而是通過(guò)誘導(dǎo)B細(xì)胞發(fā)生IgA類(lèi)型轉(zhuǎn)換,并最終分泌IgA完成的。在腸外DC(如脾臟DC,肝臟DC,脾臟DC來(lái)源的DC細(xì)胞系D1-DC)存在時(shí),RA聯(lián)合IL-5和/或IL-6也能顯著促進(jìn)B細(xì)胞IgA
4、產(chǎn)生。然而,其前題是必須有DC存在,提示DC在T細(xì)胞非依賴(lài)性IgA的產(chǎn)生中起著關(guān)鍵作用。但是,DC究竟提供了什么樣的信號(hào),是通過(guò)細(xì)胞與細(xì)胞的直接接觸起作用,還是通過(guò)分泌的可溶性介質(zhì)起作用,抑或是由于RA與IL-5和/或IL-6聯(lián)合作用于DC,增強(qiáng)DC的功能,間接作用于B細(xì)胞,而促進(jìn)B細(xì)胞IgA的產(chǎn)生?迄今未知!Tezuka等證實(shí)人腸道PP及MLN存在一類(lèi)高表達(dá)誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)的DC,而在腸外組織DC中此酶的表達(dá)很低。iNO
5、S能誘導(dǎo)DC自身表達(dá)BAFF及APRIL,后兩者通過(guò)與B細(xì)胞膜上特異受體結(jié)合誘導(dǎo)B細(xì)胞發(fā)生IgA類(lèi)型轉(zhuǎn)換。最近發(fā)現(xiàn)RA能促進(jìn)一些人腫瘤細(xì)胞株表達(dá)iNOS。這些發(fā)現(xiàn)提示:RA聯(lián)合IL-5和/或IL-6很可能通過(guò)誘導(dǎo)DC表達(dá)iNOS或者BAFF和APRIL,從而誘導(dǎo)B細(xì)胞發(fā)生IgA類(lèi)型轉(zhuǎn)換。RA聯(lián)合IL-5和/或IL-6是否也促進(jìn)DC表達(dá)經(jīng)典的MHC-Ⅰ類(lèi)或Ⅱ類(lèi)分子、共刺激分子及黏附分子,從而誘導(dǎo)初始T細(xì)胞分化為T(mén)h2細(xì)胞,進(jìn)一步介導(dǎo)T細(xì)胞
6、依賴(lài)的IgA產(chǎn)生?這些問(wèn)題都有待進(jìn)一步闡明。因此本課題旨在研究RA聯(lián)合IL-5和/或IL-6對(duì)DC表型及功能的影響,從而為進(jìn)一步闡明它們促進(jìn)B細(xì)胞分泌IgA抗體的作用機(jī)制打下基礎(chǔ)。方法:1.細(xì)胞處理:收集培養(yǎng)于RPMI-1640培養(yǎng)基的DC細(xì)胞系DC2.4,洗滌后把細(xì)胞配成10~6cell/ml,鋪于24孔板,每孔1 ml,并以9種方式處理(RA濃度為100nM,IL-5和IL-6濃度均為10ng/ml):空白對(duì)照組,即DC組;DC+R
7、A組;DC+RA+IL-5組;DC+RA+IL-6組;DC+RA+IL-5+IL-6組;DC+IL-5組;DC+IL-6組;DC+IL-5+IL-6組;DC+LPS(1μg/ml)組。把24孔板放入37℃含5%CO2的孵箱內(nèi)孵育。2.DC表型分析:收集處理2天的各組DC,用流式細(xì)胞儀檢測(cè)MHC-I類(lèi)及Ⅱ類(lèi)分子、CD86、CD80、CD54表達(dá)。3.MLR檢測(cè)經(jīng)處理的DC抗原提呈功能改變:收集處理2天的各組DC,用MTT法檢測(cè)經(jīng)處理的各組
8、DC刺激同種異型T淋巴細(xì)胞擴(kuò)增的能力。4.RT-PCR檢測(cè)DC表達(dá)iNOS、APRIL及BAFF情況:收集處理12h、24h、36h、48h、及72h的各組DC,半定量RT-PCR檢測(cè)DC的iNOS、APRIL及BAFF表達(dá)。5.NO檢測(cè):收集處理12h、24h、36h、48h、及72h的各組DC培養(yǎng)上清,用Griess試劑法檢測(cè)培養(yǎng)上清NO濃度。6.IL-23測(cè)定:收集處理3天的DC培養(yǎng)上清,用ELISA檢測(cè)培養(yǎng)上清IL-23濃度。結(jié)
9、果:1.RA聯(lián)合IL-5抑制C57BL/6脾臟來(lái)源的DC表達(dá)CD80;RA聯(lián)合IL-5和/或IL-6增強(qiáng)DC細(xì)胞系MHC-Ⅱ類(lèi)分子及CD54的表達(dá),但不影響其MHC-Ⅰ類(lèi)分子及CD86的表達(dá)。2.RA聯(lián)合IL-5和/或IL-6增強(qiáng)DC刺激同種異型T淋巴細(xì)胞增殖的能力。3.RA或RA聯(lián)合IL-5和/或IL-6促進(jìn)DCAPRIL基因的表達(dá)。4.IL-6顯著促進(jìn)了DC iNOS基因的表達(dá)及NO的分泌。5.RA聯(lián)合IL-5和/或IL-6不影響D
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