子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞分化過程中細(xì)胞周期界面的調(diào)控機(jī)制研究.pdf

1、本研究分為四部分：
　　 第一部分：體外人ESCs 蛻膜化模型的建立和鑒定
　　 目的：建立體外培養(yǎng)人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞蛻膜化的模型，并鑒定蛻膜化模型的有效性。
　　 方法：人子宮內(nèi)膜組織原代培養(yǎng)，采用8-Br-cAMP和MPA 蛻膜化方法處理第四代ESC細(xì)胞，免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測原代培養(yǎng)細(xì)胞中波形蛋白和角蛋白的表達(dá)，顯微鏡下觀察蛻膜化過程中細(xì)胞形態(tài)變化，化學(xué)發(fā)光法檢測蛻膜化不同時間點(diǎn)細(xì)胞培養(yǎng)液中PRL 水平。

2、r>　　 結(jié)果：1. 原代培養(yǎng)細(xì)胞中波形蛋白在胞漿中表達(dá)強(qiáng)陽性，角蛋白無表達(dá)；2. 蛻膜化第一天（D1）到第四天（D4）ESCs形態(tài)從長梭形逐漸變?yōu)閳A形，細(xì)胞體積變大，胞核增大，細(xì)胞邊界變模糊；3. 化學(xué)發(fā)光法檢測D1天到D4 蛻膜化組培養(yǎng)液中PRL水平逐漸升高，D4天達(dá)到蛻膜化水平，對照組PRL 水平無顯著改變。
　　 結(jié)論：采用8-Br-cAMP和MPA 蛻膜化方法處理ESCs 在D4天達(dá)到成功蛻膜化水平，是研究體外蛻膜化

3、過程的理想模型。
　　 第二部分：體外人ESCs 蛻膜化細(xì)胞周期及細(xì)胞周期芯片分析
　　 目的：研究在人ESCs 體外蛻膜化過程中細(xì)胞周期分布的差異，以及芯片分析在蛻膜化過程中細(xì)胞周期相關(guān)基因的差異性表達(dá)。
　　 方法：采用8-Br-cAMP和MPA 蛻膜化方法，分別選取體外蛻膜化0 小時（D0）、24 小時(D1)、48 小時(D2)和96 小時(D4)，采用流式細(xì)胞分析儀分析細(xì)胞周期分布的改變；選取D0～D4

4、的蛻膜化ESCs和對照進(jìn)行細(xì)胞周期芯片分析，篩選蛻膜化過程中差異表達(dá)的細(xì)胞周期相關(guān)基因。
　　 結(jié)果：體外蛻膜化過程中ESCs發(fā)生G0/1 到S 期阻滯。體外蛻膜化ESCs 蛻膜化0 小時、24 小時、48 小時和96 小時S 期比例分別為18.2%、8.51%、3.34%和0.38%，G0/G1 比例分別為65.7%、77.98%、84.88%和88.63%，G2/M 比例分別為15.47%、13.51%、11.21%和10.

5、99%。細(xì)胞周期芯片結(jié)果顯示在D2與D0 比較，差異倍數(shù)>2.0上調(diào)的基因有5個，差異倍數(shù)<0.50 下調(diào)的基因有8個；在D4與D0 比較，差異倍數(shù)>2.0 上調(diào)的基因有4個，差異倍數(shù)<0.50 下調(diào)的基因有7個。
　　 結(jié)論：TIMP3、CDKN1C、CUL4B、CDKN2B、CDK2、CCND1、CKS2、CDC6、CCNA2、CCNB1、CDC20和CDC2可能在ESC 脫離細(xì)胞周期走向分化過程中起著重要作用，但需進(jìn)一步驗

6、證。
　　 第三部分：人ESCs 體外蛻膜化和非蛻膜化的micro-RNA 芯片分析和蛻膜化相關(guān)靶基因的預(yù)測
　　 目的：研究在人ESCs 體外蛻膜化與非蛻膜化中micro-RNA的差異性表達(dá)，并且對在蛻膜化過程中microRNA 調(diào)節(jié)相關(guān)靶基因的預(yù)測。
　　 方法：采用8-Br-cAMP和MPA 蛻膜化方法，選取體外蛻膜化D4和非蛻膜化C4組ESCs，進(jìn)行microRNA 芯片的檢測，利用real-time P

7、CR對芯片結(jié)果進(jìn)行驗證；采用生物信息學(xué)預(yù)測microRNA 調(diào)節(jié)蛻膜化相關(guān)的靶基因，并進(jìn)行功能分類。
　　 結(jié)果：芯片結(jié)果顯示，蛻膜化與非蛻膜化ESCs 比較分析，49個microRNA 具有顯著性差異，16個microRNA 顯著性上調(diào)，33個microRNA 顯著性下調(diào)；選取has-miR-27b，30c，143，101，181b，29b，30d，507，107，216，139，23a，222，221 進(jìn)行real-time

8、 PCR 進(jìn)行驗證，其中has-miR-27b，30c，143，101，181b，29b，30d，507，23a，222，221 具有顯著性差異（P<0.05）；生物信息學(xué)分析預(yù)測microRNA調(diào)節(jié)蛻膜化相關(guān)的靶基因，根據(jù)靶基因的功能分為六類：1，轉(zhuǎn)錄因子和DNA 粘附蛋白；2，細(xì)胞外基質(zhì)和相關(guān)分子；3，細(xì)胞內(nèi)信號分子；4，細(xì)胞周期調(diào)節(jié)；5，生長因子，細(xì)胞因子受體和粘附蛋白；6，酶代謝相關(guān)分子。
　　 結(jié)論：在人子宮內(nèi)膜蛻膜化

9、過程中microRNA 差異性表達(dá)，可能在蛻膜化過程中發(fā)揮了重要作用。
　　 第四部分：Has-miR-222 在人ESC 蛻膜化過程中通過p57 調(diào)節(jié)ESC細(xì)胞周期
　　 目的：本文通過轉(zhuǎn)染has-miR-222 inhibitors 下調(diào)has-miR-222，研究has-miR-222對人體外蛻膜化ESCs的細(xì)胞周期和p57的調(diào)節(jié)；并構(gòu)建和共轉(zhuǎn)染p57熒光素酶報告基因載體，研究has-miR-222對細(xì)胞周期素依賴

10、性蛋白激酶抑制蛋白（CKI）p57的表達(dá)調(diào)控。
　　 方法：構(gòu)建合成2'-O-Me-222-inhibitors 寡核苷酸、陰性對照和FITC 連接的陰性對照，轉(zhuǎn)染至體外培養(yǎng)的ESCs中，轉(zhuǎn)染后6 小時在熒光顯微鏡下觀察熒光素的表達(dá)，判定轉(zhuǎn)染效率，然后再進(jìn)行體外蛻膜化48 小時后采用流式細(xì)胞分析儀分析細(xì)胞周期，采用免疫印跡方法檢測CDKN1C/p57kip2 蛋白表達(dá)，比較轉(zhuǎn)染和對照組細(xì)胞周期及CDKN1C/p57kip2 蛋白

11、的表達(dá)變化；構(gòu)建pMIR-p57 載體和對照，與has-miR-222inhibitors和對照共轉(zhuǎn)染ESCs24 小時后檢測雙熒光素酶活性，分析p57 報告基因的表達(dá)。
　　 結(jié)果：ESCs轉(zhuǎn)染has-miR-222 inhibitors后與對照組相比S 期比例從10.93%下降至6.25%，G0/G1 期比例從73.05%升高至77.52%；體外蛻膜化48 小時ESCs轉(zhuǎn)染has-miR-222 inhibitors后，S

12、期比例從7.83%下降至3.34%，G0/G1 期比例從74.94%升高至80.74%。轉(zhuǎn)染has-miR-222 inhibitors后，Western blot檢測ESCs中p57 蛋白表達(dá)顯著性升高（P<0.05）；pMIR-p57 載體和has-miR-222 inhibitors 共轉(zhuǎn)染ESCs后，與對照組相比熒光素酶的活性顯著升高（P<0.05）。
　　 結(jié)論：在體外蛻膜化過程中，隨著蛻膜化時間的增加ESCs的S 期