人外周血自然殺傷細(xì)胞與子宮內(nèi)膜細(xì)胞共培養(yǎng)分化的初步研究.pdf

1、目的：探索解離子宮細(xì)胞以及純化分離子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞與間質(zhì)細(xì)胞的最佳方法，為得到純化的子宮內(nèi)膜細(xì)胞進(jìn)行下一步研究奠定基礎(chǔ)；了解外周血淋巴細(xì)胞與子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞(EGC)和/或間質(zhì)細(xì)胞(ESC)共培養(yǎng)后的表型改變。 方法：SD大鼠16只，周齡7-8周，重200-220g。脫頸處死取子宮組織，標(biāo)記左右順序，平分四份，按如下示例分別采用0.25％胰酶+0.005％DNA酶①、0.25％Ⅰ型膠原酶+0.005％DNA酶②、0.25％胰

2、酶混合0.25％Ⅰ型膠原酶+0.005％DNA酶③以及機(jī)械研磨法④解離子宮組織(酶消化均為60min)，比較四種方法所得的解離細(xì)胞數(shù)，細(xì)胞活性，再用可得到最佳細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞活性的解離方法處理人子宮內(nèi)膜組織，用篩網(wǎng)過濾法(過濾法)和低速離心結(jié)合篩網(wǎng)過濾法(結(jié)合法)分離腺上皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞，計(jì)數(shù)分離所得細(xì)胞數(shù)，細(xì)胞免疫組化鑒定細(xì)胞的來源和純度，從細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞純度兩方面對(duì)兩種方法進(jìn)行比較，得出分離純化腺上皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞的較好方法；分離子宮內(nèi)膜

3、腺上皮細(xì)胞(EGC)和間質(zhì)細(xì)胞(ESC)；子宮內(nèi)膜細(xì)胞(EC)用含雌孕激素的培養(yǎng)液體外培養(yǎng)；EC體外培養(yǎng)3-5天，根據(jù)細(xì)胞生長情況分離患者自身外周血淋巴細(xì)胞(PBL)，以PBL: EC≈1:1密度接種，體外共培養(yǎng)。 結(jié)果：0.25％胰酶+0.005％DNA酶，0.25％Ⅰ型膠原酶+0.005％DNA酶，兩者混合酶及機(jī)械研磨所得的細(xì)胞數(shù)以Ⅰ型膠原酶組最多，具有顯著性差異，4種解離方法對(duì)細(xì)胞的損傷均較小，Ⅰ型膠原酶組所得細(xì)胞活性最高

4、，但差異無顯著性；結(jié)合法分離所得的細(xì)胞數(shù)較多和腺上皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞純度分別達(dá)90％和95％以上，與過濾法相比，在所得腺上皮細(xì)胞數(shù)和分離的間質(zhì)細(xì)胞純度兩方面明顯優(yōu)于過濾法，差異具有顯著性；共培養(yǎng)后(含雌孕激素)，流式檢測外周血NK細(xì)胞CD3-CD56(+)CD16(—)(CD16(—))、CD3(—)CD56(+)CD16+(CD16+)及 CD3(—)CD56(+):CD3(—)CD56(+)CD16(—)+CD3(—)CD56(+)C

5、D16(+)三種亞型。結(jié)果提示PBL體外培養(yǎng)14天細(xì)胞活性明顯下降，三種亞型NK細(xì)胞隨培養(yǎng)時(shí)間延長未出現(xiàn)顯著性變化；子宮內(nèi)膜uNK細(xì)胞與ESC共培養(yǎng)14天，三種亞型NK細(xì)胞未出現(xiàn)顯著性變化；與子宮內(nèi)膜細(xì)胞共培養(yǎng)的三組PBL，CD16(—)亞型NK細(xì)胞均隨培養(yǎng)時(shí)間延長而增加，4個(gè)時(shí)間點(diǎn)差異具有顯著性，但未發(fā)現(xiàn)三組之間存在作用效果的差異；CD16(+)亞型及CD3(—)CD56(+)亞型NK細(xì)胞在培養(yǎng)時(shí)間和培養(yǎng)分組上未出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

6、 結(jié)論：0.25％Ⅰ型膠原酶與0.005％DNA酶消化大鼠子宮組織所得的細(xì)胞數(shù)較高，細(xì)胞活性較好，可作為解離子宮細(xì)胞的最佳處理方法；低速離心結(jié)合篩網(wǎng)過濾法分離腺上皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞所得細(xì)胞純度較高，回收細(xì)胞數(shù)較多，尤其是腺上皮細(xì)胞的回收率較高，是一種較佳的分離純化子宮內(nèi)膜細(xì)胞的處理方法；外周血CD56(+)CD16(-) NK細(xì)胞在雌孕激素培養(yǎng)液中不發(fā)生增殖；分泌期子宮內(nèi)膜uNK細(xì)胞在雌孕激素培養(yǎng)液中未表現(xiàn)出局部增殖活性；外周血CD56