人胚胎干細胞定向誘導(dǎo)生成內(nèi)皮祖細胞及內(nèi)皮細胞促進腫瘤生長的作用研究及機制初探.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、近年來,內(nèi)皮細胞(ECs)的研究與應(yīng)用價值受到科學(xué)家的廣泛關(guān)注,對內(nèi)皮細胞或內(nèi)皮祖細胞發(fā)育分化調(diào)控機制及其應(yīng)用價值的研究日益拓展和深入。內(nèi)皮祖細胞(EPCs)作為血管內(nèi)皮的前體細胞,在一定的條件下可以增生并分化為血管內(nèi)皮細胞,從而有望在很多臨床治療中扮演重要角色。但內(nèi)皮祖細胞來源非常有限,其只占外周血單個核細胞的0.02-0.1%。人胚胎干細胞(hESCs)為目前最為重要的再生醫(yī)學(xué)種子細胞之一,與其他干細胞相比具有更強的增殖能力、多能性

2、及低免疫原性,由hESCs誘導(dǎo)分化為EPCs有望成為我們獲得EPCs或者是內(nèi)ECs的重要來源。但是,hESCs向ECs總體分化效率不高,如何獲取足夠數(shù)量的有功能的ECs仍是當(dāng)前面臨的最大挑戰(zhàn)。除此之外,hESC體外向EPCs/ECs的分化亦為研究內(nèi)皮細胞的生物學(xué)特性以及內(nèi)皮細胞發(fā)育分化的調(diào)控機制提供了不可多得的模型。
   內(nèi)皮細胞像一把雙刃劍,不僅在再生醫(yī)學(xué)中具有非常重要的價值,其本身的增殖又與異常血管發(fā)育、惡性腫瘤等多種疾病

3、的發(fā)生與發(fā)展密切相關(guān)。目前,探討血管內(nèi)皮細胞在生理和病理狀態(tài)下的增殖發(fā)育與功能發(fā)揮的調(diào)控機制,從而開展以血管內(nèi)皮為靶標(biāo)的治療受到越來越多的關(guān)注,如VEGF在惡性腫瘤發(fā)生與發(fā)展中的作用日益明確,VEGF抗體的臨床價值受到廣泛肯定。研究表明,作為實體腫瘤顯著生理學(xué)特征的低氧是VEGF重要誘導(dǎo)因素之一,而低氧的生物學(xué)作用無疑主要是通過低氧誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子(HIF)介導(dǎo)完成的。那么,HIF在血管內(nèi)皮增殖及其生物學(xué)功能的發(fā)揮中扮演怎樣的角色是值得關(guān)注

4、的問題。HIF家族中最重要的一個成員是HIF-1,其活性主要與α亞基有關(guān)。內(nèi)皮細胞中HIF-1α被抑制之后,腫瘤細胞的生長與浸潤等生物學(xué)活性是否受到影響,如果是,HIF-1α又是通過怎樣的機制發(fā)揮其作用的?對這些問題的回答無疑將有助于我們更好的理解血管內(nèi)皮細胞對于腫瘤細胞的作用,為進一步以血管內(nèi)皮細胞為靶點的腫瘤治療提供新的策略。
   基于此,本課題的研究分為二部分完成:
   一.人胚胎干細胞定向誘導(dǎo)生成內(nèi)皮祖細胞<

5、br>   保持良好干性的hESCs經(jīng)膠原酶消化后,與MEF共培養(yǎng),利用4步程序性誘導(dǎo)方法使其向內(nèi)皮祖細胞分化:含有BMP4(10ng/ml)的培養(yǎng)基培養(yǎng)4天→去除BMP4后培養(yǎng)6天→使用MiniMACS系統(tǒng)分選CD34+細胞→使用EGM-2培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)7-10天。對誘導(dǎo)分化后的細胞進行形態(tài)學(xué)、特異基因表達及功能等方面的系列檢測,與此同時,對誘導(dǎo)分化后的細胞在EGM-2培養(yǎng)體系中繼續(xù)擴增培養(yǎng)。
   結(jié)果表明:誘導(dǎo)后的細胞呈

6、梭形,形態(tài)均一,生長穩(wěn)定,原代及傳代后的細胞RT-PCR法均能檢測到內(nèi)皮細胞相關(guān)基因CD31、CD34、VE-cad、KDR、vWF、eNOS及平滑肌相關(guān)基因α-SMA;免疫熒光染色表達CD31、VE-cad和VEGF;能夠吞噬低密度脂蛋白,并在Matrigel基質(zhì)膠上形成管腔樣結(jié)構(gòu);更換為平滑肌細胞培養(yǎng)基后,細胞增寬,體積增大,α-SMA基因表達增強22倍,免疫熒光染色可檢測到α-SMA蛋白。不同代數(shù)細胞基因表達差異不明顯。說明hES

7、Cs可以有效的誘導(dǎo)為EPCs,EPCs具有內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞雙向分化能力。
   二.內(nèi)皮細胞促進腫瘤生長的作用研究及機制初探
   在本部分實驗中,我們首先分離、培養(yǎng)并鑒定人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVECs),進而明確內(nèi)皮細胞與腫瘤細胞的相互作用,利用裸鼠成瘤性實驗明確內(nèi)皮細胞在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的生物學(xué)作用。與此同時,在以上實驗基礎(chǔ)上我們利用SiRNA干涉內(nèi)皮細胞的HIF-1α的表達,初步探討HIF-1α在內(nèi)皮細胞的生物學(xué)

8、功能發(fā)揮中所扮演的角色。
   結(jié)果表明:內(nèi)皮細胞促進腫瘤細胞的遷移,侵襲能力,促進移植瘤的生長,參與并促進腫瘤血管形成;腫瘤細胞上調(diào)內(nèi)皮細胞HIF-1α的表達。SiRNA干涉內(nèi)皮細胞HIF-1α的表達后,體外對腫瘤細胞的遷移、侵襲能力的促進明顯下降,體內(nèi)移植瘤生長速度及腫瘤血管密度與單獨移植腫瘤組無明顯差異,但較正常內(nèi)皮細胞組明顯下降。說明HIF-1α在內(nèi)皮細胞促進腫瘤血管形成過程中發(fā)揮了關(guān)鍵性的作用。
   本課題通

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