山羊內(nèi)皮祖細胞和人臍靜脈內(nèi)皮細胞的體外培養(yǎng)及eNOS cDNA的克隆.pdf

1、目的:通過對山羊內(nèi)皮祖細胞和人臍靜脈內(nèi)皮細胞的體外培養(yǎng)，以及eNOS cDNA的克隆鑒定，為以后下一步試驗打下基礎方法:1.采集山羊外周血，磷酸鹽緩沖液(PBS)等比稀釋后，將淋巴細胞分離液和稀釋血以2:3的比例依次加入離心管中，在水平離心機中以離心力400g，時間20分鐘密度梯度離心分離單個核細胞。將分離出的單核細胞洗滌兩次后，重懸細胞，顯微鏡下計數(shù)，調(diào)整細胞密度后將細胞接種于培養(yǎng)瓶，用含20％胎牛血清、10ng/mL血管內(nèi)皮生長因子

2、(VEGF)誘導培養(yǎng)。在光學顯微鏡下觀察細胞生長情況，并對培養(yǎng)2周的細胞采用使用免疫熒光染色的方法鑒CD133 2.產(chǎn)后新鮮臍帶，無菌剪取10-15厘米長一段，吸取溫PBS液注入臍靜脈中沈去殘血，在入口處用線繩扎緊，以防液體返流。用血管鉗夾緊臍帶一端，從另一端向臍靜脈中徐徐注入終濃度為0.2％的胰酶，充滿血管，消化10分鐘；注入口用線繩扎，以防液體返流。吸出含有內(nèi)皮細胞的消化液，于離心管中，注入溫PBS輕輕反復沖洗后，一并注入離心管中離

3、心去上清，加入RPMI1640培養(yǎng)液制成細胞懸液，接種入培養(yǎng)器皿中，置溫箱培養(yǎng)。兩至三天可見細胞長成單層，在光學顯微鏡下觀察細胞生長情況，并使用免疫組化的方法鑒CD31 3.根據(jù)基因文庫報道的eNOS cDNA序列合成引物分段擴增全編碼區(qū)，所得片段標記P12和P34,并在P12兩端分別加上限制性內(nèi)切酶Ecorl和Kpn I酶切位點。P34兩端分別加上限制性內(nèi)切酶Kpn 1和Xba I酶切位點，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳初步鑒定后，回收、純化目的片