VEGF基因轉(zhuǎn)染脂肪組織來(lái)源干細(xì)胞提高游離脂肪移植存活率的研究.pdf

1、背景: 自體脂肪組織作為理想的軟組織填充材料，因其生物相容性優(yōu)于人工組織代用品、異體及異種材料，且無(wú)免疫排斥現(xiàn)象，從而得到了廣泛應(yīng)用。自Neuber于1893年率先應(yīng)用多個(gè)自體游離的小脂肪塊填充軟組織缺損以來(lái)至今已達(dá)一百多年，然而移植脂肪組織顆粒的高吸收率和低存活率的問(wèn)題一直在困擾著整形外科學(xué)者。 組織學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，自體脂肪移植后的再血管化最早發(fā)生于手術(shù)后48小時(shí)，早期的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)主要依賴供體周圍組織液的血漿營(yíng)養(yǎng)，但這種營(yíng)養(yǎng)

2、供應(yīng)是有限的，再血管化不及時(shí)或不充分將極大的影響脂肪細(xì)胞的存活，導(dǎo)致其變性、壞死、形成囊腔并逐漸吸收。因此，及時(shí)、充分的再血管化可能是有效提高脂肪移植存活率的關(guān)鍵。 血管生物學(xué)研究表明，一些細(xì)胞因子在改善缺血組織存活率方面扮演了重要的角色，其中之一就是血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（VEGF）。關(guān)于外源性VEGF促進(jìn)皮瓣等缺血組織新生血管的形成已有相關(guān)報(bào)導(dǎo)。然而，外源性細(xì)胞因子所能夠發(fā)揮的療效極大地受制于移植物中血管內(nèi)皮細(xì)胞的數(shù)目。因此，

3、另一種研究的思路就是設(shè)法增加移植物中內(nèi)皮細(xì)胞的數(shù)量。2001年ZUK和ZHU首次從人抽脂術(shù)獲得的脂肪組織中分離得到具有多向分化潛能的干細(xì)胞，稱為脂肪組織來(lái)源的干細(xì)胞（ASCs），引起廣大學(xué)者的關(guān)注。抽脂術(shù)分離ASCs具有獲取途徑簡(jiǎn)單、獲得率高，對(duì)病人創(chuàng)傷小等優(yōu)點(diǎn)。研究表明，ASCs具有分泌細(xì)胞因子促進(jìn)血管形成，并具有向脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、骨細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、心肌細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞、血管內(nèi)皮祖細(xì)胞等方向分化的潛能。但這些僅是在體外

4、特定的定向誘導(dǎo)條件下ASCs表達(dá)了不同系細(xì)胞的特征，體內(nèi)組織細(xì)胞的生長(zhǎng)受到神經(jīng)、體液和周圍環(huán)境等諸多因素的影響，ASCs在體內(nèi)環(huán)境下是否具備向不同系分化的能力尚未明了。 就目前的研究而言，不論是國(guó)內(nèi)或是國(guó)外文獻(xiàn)，尚未見(jiàn)將血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（VEGF）與脂肪干細(xì)胞聯(lián)合治療提高游離脂肪移植存活率的報(bào)導(dǎo)。 目的: 探索ASCs在體內(nèi)是否能促進(jìn)游離移植脂肪組織血運(yùn)的重建，從而提高脂肪組織的存活率，研究ASCs輔助移植做

5、為一種細(xì)胞療法的可行性。同時(shí)還研究了VEGF基因轉(zhuǎn)染ASCs聯(lián)合治療能否進(jìn)一步增強(qiáng)這種療效。 方法: 1．脂肪組織來(lái)源干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及鑒定 取人吸脂術(shù)抽吸物的脂質(zhì)部分，使用酶消化法進(jìn)行原代細(xì)胞培養(yǎng)及傳代培養(yǎng)，觀察細(xì)胞形態(tài)及功能變化，以第三代ASCs行成脂、成骨、成軟骨分化鑒定。 2．DiⅠ標(biāo)記人脂肪干細(xì)胞 紅色熒光染料DiⅠ體外標(biāo)記ASCs，倒置顯微鏡及熒光顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況。 3．

6、Ad-VEGF165體外轉(zhuǎn)染ASCs及轉(zhuǎn)染后目的基因表達(dá) 前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)腺病毒轉(zhuǎn)染ASCs時(shí)，感染復(fù)數(shù)（MOI）值為50時(shí)較理想，轉(zhuǎn)染率可達(dá)到90%以上，故按50進(jìn)行轉(zhuǎn)染。通過(guò)免疫細(xì)胞熒光檢測(cè)VEGF在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)情況，同時(shí)利用ELISA測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)上清液中VEGF濃度水平。 4．脂肪移植模型制備及分組 將A、B、C、D四組移植物隨機(jī)注入每只裸鼠背部皮下：A組為轉(zhuǎn)染了VEGF的ASCs與脂肪組織混合物；B組為未轉(zhuǎn)染

7、VEGF的ASCs與脂肪；C組為胰島素與脂肪混合物；D組為培養(yǎng)基與脂肪混合做為空白對(duì)照。 5．脂肪移植術(shù)后觀察 術(shù)后6個(gè)月對(duì)游離移植脂肪組織進(jìn)行觀察，指標(biāo)有：（1）各組脂肪組織濕重測(cè)定；（2）纖維化及壞死程度的測(cè)定；（3）移植物中毛細(xì)血管數(shù)目；（4）移植物中毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的起源。 6．統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，使用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS13．0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。采用重復(fù)測(cè)量方差分析，均數(shù)兩兩之

8、間的比較采用LSD檢驗(yàn)。 結(jié)果; 1．分離培養(yǎng)的ASCs形態(tài)類似于成纖維細(xì)胞，具有很強(qiáng)的增殖及多向分化能力。在成脂、成骨及成軟骨分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基的作用下，分化出成熟的脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞，油紅O、茜素紅染色和阿利新藍(lán)染色陽(yáng)性。 2．DiⅠ標(biāo)記后熒光顯微鏡下觀察，見(jiàn)全部脂肪干細(xì)胞標(biāo)記后均顯紅色熒光，標(biāo)記的脂肪干細(xì)胞呈梭形，胞漿豐富，保持了良好的正常形態(tài)，DiⅠ標(biāo)記陽(yáng)性率為100%，細(xì)胞核未染熒光。該熒光染料不

9、破壞細(xì)胞，不干擾細(xì)胞增殖，染色效果好，是脂肪干細(xì)胞示蹤的好方法。 3．VEGF轉(zhuǎn)染ASCs72小時(shí)后，超過(guò)90%ASCs免疫熒光染色顯陽(yáng)性，未轉(zhuǎn)染的ASCs僅有少許熒光染色顯陽(yáng)性。轉(zhuǎn)染組上清液中VEGF的分泌水平明顯高于非轉(zhuǎn)染對(duì)照組（P<0．01）。 4．（1）6個(gè)月后各組移植脂肪濕重分別為：VEGF基因轉(zhuǎn)染ASCs組（190．91±29．51mg），ASCs組（165．90±32．47mg），胰島素組（98．45±13

10、．36mg），培養(yǎng)基對(duì)照組（71．69±15．59mg），各組之間兩兩比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。（2）組織學(xué)切片觀察結(jié)果：C、D組移植物中大部分脂肪壞死，大量纖維組織增生。A、B組存活的脂肪結(jié)構(gòu)保持較完整，纖維增生明顯少于對(duì)照組。（3）毛細(xì)血管計(jì)數(shù)結(jié)果：四組移植物的血管密度計(jì)數(shù)分別為A組（42．17±5．80）個(gè)/20HP，B組（16．89±6．15）個(gè)/20HP，C組（6．67±2．99）個(gè)/20HP，D組（2．28±0．75）個(gè)/20HP。

11、A組毛細(xì)血管數(shù)目顯著多于其余三組，B組也有較多的毛細(xì)血管，C、D組僅有少許血管分布其中。（4）移植物中毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的起源：DiⅠ標(biāo)記的發(fā)出紅色熒光的ASCs存在于A、B組移植物的部分血管中，并散在分布于部分脂肪細(xì)胞中。小鼠抗人CD31及山羊抗小鼠IgG-FITC標(biāo)記顯示出綠色熒光的血管環(huán)。圖像疊加證實(shí)，ASCs在體內(nèi)能夠部分轉(zhuǎn)化為血管內(nèi)皮細(xì)胞及脂肪細(xì)胞。B、C組熒光顯微鏡觀察未見(jiàn)血管環(huán)，僅有一些本底熒光。 討論: 目

12、前，游離脂肪移植仍存在高吸收率和低存活率的問(wèn)題。游離的脂肪組織移植到受區(qū)以后，其血液供應(yīng)是成活的基礎(chǔ)。早期的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)主要依賴供體周圍組織液的血漿營(yíng)養(yǎng)，但這種營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)是有限的，不能保證供體的長(zhǎng)期存活，僅能幫助其渡過(guò)早期的缺血缺氧狀態(tài)。移植48小時(shí)后，供體組織開(kāi)始與受區(qū)血管床建立新的血液循環(huán)，此再血管化過(guò)程是游離移植能否成功的決定因素，再血管化不及時(shí)或不充分都會(huì)導(dǎo)致供體組織發(fā)生壞死。因此探索促進(jìn)游離移植脂肪組織再血管化的手段，是整形外科技術(shù)

13、發(fā)展的迫切需要。 細(xì)胞療法可能是解決脂肪移植后早期再血管化問(wèn)題的一種有效辦法。 細(xì)胞療法是指應(yīng)用自體、異體或同種異體的細(xì)胞，經(jīng)體外操作后回輸（或植入）人體，以達(dá)到治療、診斷或預(yù)防作用的目的。細(xì)胞療法最初和最成功的范例是輸血和骨髓、造血干細(xì)胞移植。近年來(lái)，隨著人們對(duì)于細(xì)胞研究的不斷深入，細(xì)胞療法的治療領(lǐng)域不斷拓寬，延伸到了腫瘤的生物治療、免疫治療，糖尿病、冠心病、促進(jìn)血管生成和創(chuàng)面愈合等領(lǐng)域。研究表明，ASCs具有分泌細(xì)胞

14、因子促進(jìn)血管形成，并具有向脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、骨細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等方向分化的潛能。ASCs與其它的干細(xì)胞相比有顯著的優(yōu)越性：①ASCs容易獲得，對(duì)患者造成的痛苦小。②ASCs在體外增殖速度快，不必進(jìn)行永生化處理就能獲得足夠量的細(xì)胞用于移植。③ASCs能夠進(jìn)行自體移植，無(wú)免疫排斥的反應(yīng)。 本實(shí)驗(yàn)通過(guò)從人抽脂術(shù)獲得的脂肪組織中分離得到的ASCs，與取自人體的脂肪混合移植于裸鼠。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：裸鼠背部移植的脂肪組織術(shù)后6個(gè)月ASCs組移

15、植脂肪組織存活率高于胰島素組及對(duì)照組。ASCs組存活的脂肪組織質(zhì)地較軟，脂肪結(jié)構(gòu)保持較完整，脂肪小葉及小葉間隔保持較好，脂肪纖維化及壞死程度低于胰島素組及對(duì)照組。熒光示蹤證實(shí)ASCs存在于移植脂肪的部分脂肪細(xì)胞及小葉間隔中，在體內(nèi)能夠部分轉(zhuǎn)化為血管內(nèi)皮細(xì)胞及脂肪細(xì)胞，促進(jìn)了游離移植脂肪組織的再血管化。 血管生物學(xué)研究表明，一些細(xì)胞因子在改善缺血組織存活率方面扮演了重要的角色，VEGF作用于血管形成的早期，可以促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增生

16、，并改善血管的通透性。VEGF應(yīng)用方式一般可分為直接應(yīng)用和間接應(yīng)用。直接應(yīng)用VEGF有其局限性：①VEGF價(jià)格昂貴；②難以在體內(nèi)保持持續(xù)的有效濃度；⑨不能自我調(diào)節(jié)。間接應(yīng)用是利用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)將基因整合進(jìn)宿主細(xì)胞，將一些能產(chǎn)生VEGF的細(xì)胞種植在局部組織，使其在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)持續(xù)、穩(wěn)定地產(chǎn)生VEGF，能很好地克服直接應(yīng)用的缺陷。本實(shí)驗(yàn)即采用這種間接應(yīng)用的方法，使用ASCs作為載體持續(xù)釋放內(nèi)源性的VEGF。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，VEGF基因轉(zhuǎn)染ASCs

17、組能有效提高脂肪移植存活率，增加移植物中毛細(xì)血管的密度，其療效優(yōu)于未轉(zhuǎn)染的ASCs組。已有很多研究證實(shí)VEGF能有力的促進(jìn)移植物的再血管化，但以ASCs作為載體釋放內(nèi)源性的VEGF以提高游離脂肪移植存活率國(guó)內(nèi)外未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)。 結(jié)論: ASCs在體內(nèi)能夠分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞及脂肪細(xì)胞并促進(jìn)了游離移植脂肪組織的血運(yùn)重建，減輕了脂肪組織的纖維化，改善了存活脂肪的質(zhì)地，提高了移植脂肪的存活率。ASCs輔助移植是一種有效的細(xì)胞療法