棕色脂肪組織來(lái)源的干細(xì)胞向起搏細(xì)胞的定向分化.pdf

1、用再生醫(yī)學(xué)的理念構(gòu)建生物心臟起搏器給病竇綜合征等嚴(yán)重緩慢型心律失常的治療帶來(lái)了新希望。目前,構(gòu)建生物心臟起搏器的方法主要有:基因轉(zhuǎn)染、細(xì)胞移植和組織工程體外構(gòu)建等。基因轉(zhuǎn)染的安全性及長(zhǎng)期有效性有待解決,而細(xì)胞移植和組織工程方法均需要種子細(xì)胞-起搏樣細(xì)胞,所以尋找合適的種子細(xì)胞已成為構(gòu)建生物心臟起搏器的關(guān)鍵。
　　 目前,起搏細(xì)胞的來(lái)源包括:(1)成體細(xì)胞,如竇房結(jié)細(xì)胞,幼稚心臟細(xì)胞及轉(zhuǎn)基因的心肌細(xì)胞;(2)各類干細(xì)胞,可在體外或

2、體內(nèi)誘導(dǎo)成為起搏細(xì)胞,如胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells,ESCs)、誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(induced p luripotentstem cells,iPS)和成體干細(xì)胞(adult stem cell)等。其中,成體干細(xì)胞具有廣闊的臨床應(yīng)用前景,而其他細(xì)胞則存在細(xì)胞來(lái)源、免疫排斥、成腫瘤或倫理安全等問(wèn)題。
　　 近年來(lái)的研究表明,脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(adipose-derived stem cells,ASC

3、s)和去分化脂肪細(xì)胞(dedifferentiated fat cells,DFAT)在體外能夠被誘導(dǎo)甚至自發(fā)分化為跳動(dòng)的心肌細(xì)胞,然而,也有部分研究認(rèn)為ASCs不能被誘導(dǎo)分化為心肌細(xì)胞。分析這些研究,我們認(rèn)為誘導(dǎo)分化成功的關(guān)鍵除了培養(yǎng)分化條件外,還可能與脂肪組織的取材部位有關(guān),不同部位脂肪組織的差異可能導(dǎo)致了誘導(dǎo)分化結(jié)果的不一致。更重要的是,分化后跳動(dòng)的心肌細(xì)胞是否是起搏細(xì)胞或是否具有起搏細(xì)胞的特征尚未得到證實(shí)。
　　 本研究

4、旨在明確脂肪組織常用取材部位肩胛間和腹股溝區(qū)脂肪組織的差異,以及其來(lái)源的干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化的能力,并驗(yàn)證這種分化后細(xì)胞的起搏特征,為進(jìn)一步構(gòu)建生物心臟起搏器奠定基礎(chǔ)。
　　 第一部分肩胛間和腹股溝皮下脂肪組織的特征及差異
　　 研究目的:研究小鼠肩胛間和腹股溝皮下脂肪組織的特征及差異。
　　 材料和方法:分別取小鼠肩胛間脂肪和腹股溝皮下脂肪,大體形態(tài)觀察兩種組織差別,組織切片HE染色觀察組織細(xì)胞構(gòu)成差異,透射電

5、鏡觀察脂肪細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)。提取組織RNA,分析兩種脂肪組織基因表達(dá)。
　　 結(jié)果:大體形態(tài)觀察表明,小鼠肩胛間脂肪呈棕褐色,而腹股溝皮下脂肪外觀為亮白色。HE染色發(fā)現(xiàn),肩胛間脂肪含量大量棕色脂肪細(xì)胞,少量白色脂肪細(xì)胞混雜其中;腹股溝處皮下脂肪大部分為白色脂肪細(xì)胞,但淋巴結(jié)周圍有棕色脂肪細(xì)胞存在。棕色脂肪細(xì)胞小而含分散脂滴,白色脂肪細(xì)胞大,含單房脂滴。透射電鏡超微結(jié)構(gòu)觀察,棕色脂肪細(xì)胞內(nèi)線粒體大而豐富,而白色脂肪細(xì)胞線粒體小且少?；?/p>

6、因表達(dá)分析,脂肪和心肌相關(guān)基因分別表達(dá)與脂肪組織和心肌組織中,個(gè)別心臟發(fā)育早期基因表達(dá)于脂肪組織中。
　　 結(jié)論:肩胛間部位脂肪組織主要為棕色脂肪,其中僅有少量白色脂肪;而腹股溝皮下脂肪組織主要為白色脂肪,在淋巴結(jié)周圍有棕色脂肪細(xì)胞分布。兩種脂肪細(xì)胞有明顯的形態(tài)學(xué)差異。
　　 第二部分棕色脂肪組織來(lái)源的干細(xì)胞向心肌細(xì)胞的定向分化
　　 研究目的:研究并比較來(lái)自白色和棕色脂肪的干細(xì)胞體外向心肌細(xì)胞分化的能力。

7、>　　 材料和方法:分別取腹股溝皮下白色脂肪和肩胛間棕色脂肪組織經(jīng)膠原酶消化離心后,取下層間充質(zhì)干細(xì)胞在20％FBS中常規(guī)培養(yǎng),取上層漂浮的成熟脂肪細(xì)胞經(jīng)天花板培養(yǎng)待貼壁或去分化后在20％FBS中常規(guī)培養(yǎng),免疫細(xì)胞化學(xué)方法及基因表達(dá)鑒定心肌細(xì)胞的標(biāo)志物。
　　 結(jié)果:棕色脂肪來(lái)源的ASCs培養(yǎng)1周即可見有自發(fā)搏動(dòng)的肌管狀細(xì)胞或小圓形細(xì)胞,自發(fā)搏動(dòng)頻率大約130次/分鐘,表達(dá)α-actinin、troponin T/tropon

8、inI和Cx40等。而白色ASCs培養(yǎng)后呈現(xiàn)成纖維細(xì)胞樣改變,α-actinin為陰性,少量細(xì)胞Troponin T/Troponin I和Cx40弱陽(yáng)性。棕色DFAT培養(yǎng)后3周后形成有肌管狀細(xì)胞并逐漸成片搏動(dòng),培養(yǎng)2周時(shí)即表達(dá)超極化激活環(huán)核苷酸門控通道(Hyperpo larization-act ivated cyclic nucleotide-gated channels,HCN)2、4和縫隙連接蛋白Cx45。而白色DFAT未見分

9、化為肌管狀細(xì)胞,培養(yǎng)2周時(shí)HCN2、HCN4和Cx45表達(dá)呈弱陽(yáng)性。
　　 結(jié)論:來(lái)自棕色脂肪的ASCs和DFAT細(xì)胞在體外可以定向分化為自發(fā)搏動(dòng)的心肌細(xì)胞,而來(lái)自白色脂肪的ASCs和DFAT細(xì)胞則不能。
　　 第三部分自發(fā)搏動(dòng)心肌細(xì)胞的起搏細(xì)胞特征鑒定
　　 研究目的:研究來(lái)自棕色脂肪的干細(xì)胞分化的自發(fā)搏動(dòng)的心肌細(xì)胞是否具有起搏細(xì)胞的特征。
　　 材料和方法:通過(guò)免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定細(xì)胞起搏特征離子通道蛋白

10、HCN4的表達(dá),細(xì)胞內(nèi)鈣成像檢測(cè)鈣瞬變,細(xì)胞膜片鉗檢測(cè)細(xì)胞的動(dòng)作電位,藥理學(xué)檢測(cè)其心肌細(xì)胞的功能,透射電鏡觀察細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)。
　　 結(jié)果:棕色脂肪來(lái)源的ASCs和DFAT分化的自發(fā)搏動(dòng)的心肌細(xì)胞均高表達(dá)HCN4。ASCs有自發(fā)鈣瞬變現(xiàn)象,并可記錄到其自發(fā)的動(dòng)作電位。異丙腎上腺素(isoproterenol, ISO)或去甲腎上腺素(norepinephrine,NE)可使搏動(dòng)心肌細(xì)胞的搏動(dòng)加快,而乙酰膽堿(acetylcho