Tmub1在IL-6誘導(dǎo)的肝細(xì)胞增殖過程中的作用及其表達(dá)調(diào)控的研究.pdf

1、研究背景：
　　 肝功能衰竭是各類肝臟疾病的終末期狀態(tài)，常見而又難以得到有效治療。我們知道，肝臟切除過多會(huì)導(dǎo)致術(shù)后肝功能衰竭，這就大大限制了肝臟外科手術(shù)的開展。由于肝臟功能的復(fù)雜性，人工肝技術(shù)并不能完全替代肝臟功能，而且其遠(yuǎn)期療效難以令人滿意；肝臟移植由于供體數(shù)量、免疫排斥、治療費(fèi)用等原因，也不能廣泛開展。所以，有效刺激自身肝再生則是解決這些問題的理想途徑。正常成體的肝細(xì)胞為穩(wěn)定細(xì)胞，極少發(fā)生有絲分裂，但在受到損傷和其他因素刺激

2、時(shí)殘余肝細(xì)胞會(huì)迅速出現(xiàn)活躍的分裂增殖，并呈現(xiàn)明顯的規(guī)律性，這就告訴我們：如果能夠合理刺激肝病患者自身肝臟的再生，則可彌補(bǔ)生物人工肝和肝移植技術(shù)的不足，有效解決肝功能衰竭。國(guó)內(nèi)外也積極開展了針對(duì)肝臟再生的很多研究，由于其機(jī)制迄今還不完全清楚，進(jìn)展并不理想。
　　 Tmub1(transmemebrane and ubiquitin-like domain containing1)是2005年首次被Fazia等報(bào)道的新分子，在肝細(xì)胞

3、增殖過程中發(fā)揮重要作用，Tmub1在肝再生過程中表達(dá)明顯升高，而且過表達(dá)的Tmub1對(duì)細(xì)胞增殖起抑制作用[1]。本課題組對(duì)大鼠肝部分切除后基因表達(dá)譜進(jìn)行分析時(shí)，也發(fā)現(xiàn)肝部分切除后大鼠的Tmub1基因表達(dá)明顯上調(diào)。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)Tmub1可在一定程度上STAT3表達(dá)及活化，提示Tmub1在肝細(xì)胞增殖過程中可能發(fā)揮負(fù)反饋調(diào)控作用，但其具體的作用機(jī)制還有待深入研究。鈣離子信號(hào)調(diào)節(jié)親環(huán)素配體(Calcium modulating cyclophil

4、in ligand，CAML)在所有組織中都有表達(dá)，在細(xì)胞增殖、凋亡和功能中發(fā)揮重要作用。最近的研究發(fā)現(xiàn)CAML是Tmub1的靶蛋白，但沒有對(duì)其具體的作用機(jī)制進(jìn)行闡述，更沒有對(duì)肝再生將產(chǎn)生怎樣的影響開展研究。在肝細(xì)胞增殖再生過程中，如果Tmub1和CAML能發(fā)生相互作用，將可能對(duì)肝細(xì)胞增殖產(chǎn)生影響，這可能是Tmub1調(diào)控肝細(xì)胞增殖的機(jī)制之一。IL-6是肝細(xì)胞增殖啟動(dòng)信號(hào)中非常重要的組成部分，對(duì)多種增殖特異性基因的表達(dá)發(fā)揮直接或間接的調(diào)控

5、作用。本課題組前期也發(fā)現(xiàn)IL-6能上調(diào)Tmub1的表達(dá)，提示Tmub1的表達(dá)調(diào)控和IL-6信號(hào)通路有關(guān)。因此明確IL-6及其下游分子與Tmub1表達(dá)之間的關(guān)系，對(duì)闡明Tmub1基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制具有重要意義。如果有機(jī)會(huì)探明Tmub1的分子特征及其表達(dá)調(diào)控機(jī)制，將為從新的角度探討肝再生及肝細(xì)胞增殖過程的分子調(diào)控機(jī)制提供新的依據(jù)，具有重要的臨床意義。
　　 研究目的：
　　 1.明確Tmub1對(duì)肝細(xì)胞增殖能力的影響，尤其是明確

6、Tmub1在IL-6誘導(dǎo)的肝細(xì)胞增殖中的作用。
　　 2.明確增殖的肝細(xì)胞中是否存在Tmub1和CAML的相互作用，并了解其可能的作用機(jī)制。
　　 3.了解IL-6調(diào)控Tmub1基因表達(dá)的可能機(jī)制，明確可能參與Tmub1轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄因子。
　　 4.明確IL-6下游轉(zhuǎn)錄因子C/EBPβ與Tmub1表達(dá)之間的關(guān)系。
　　 材料方法：
　　 1.采用Tmub1基因shRNA慢病毒載體抑制大鼠肝細(xì)胞中Tm

7、ub1的表達(dá)，并使用IL-6誘導(dǎo)肝細(xì)胞增殖，采用[3H]-TdR摻入實(shí)驗(yàn)檢測(cè)肝細(xì)胞增殖能力變化，采用RT-PCR、Western-blot技術(shù)檢測(cè)Tmub1基因表達(dá)的情況。
　　 2.采用免疫共沉淀、激光共聚焦實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證大鼠肝細(xì)胞內(nèi)是否存在Tmub1和CAML的相互作用，同時(shí)在抑制Tmub1表達(dá)的情況下檢測(cè)Tmub1對(duì)肝細(xì)胞中CAML蛋白含量及鈣離子內(nèi)流的影響。
　　 3.采用啟動(dòng)子在線分析軟件分析Tmub1基因5’端上游

8、序列，尋找和肝再生相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的潛在結(jié)合位點(diǎn)。
　　 5.根據(jù)生物信息學(xué)分析的結(jié)果，構(gòu)建一系列Tmub1基因5’端上游序列的螢光素酶報(bào)告基因載體，將所構(gòu)建載體轉(zhuǎn)染入肝細(xì)胞，檢測(cè)各刪除序列的啟動(dòng)子活性，同時(shí)檢測(cè)IL-6對(duì)Tmub1啟動(dòng)子活性的影響。
　　 6.合成大鼠C/EBPβ的siRNA并轉(zhuǎn)染入BRL-3A細(xì)胞，在抑制C/EBPβ表達(dá)的條件下，觀察C/EBPβ對(duì)Tmub1表達(dá)的影響。
　　 7.構(gòu)建C/EBPβ

9、過表達(dá)載體，將C/EBPβ過表達(dá)載體和Tmub1螢光素酶報(bào)告基因載體共轉(zhuǎn)染入BRL-3A細(xì)胞，并觀察C/EBPβ對(duì)Tmub1基因基因5’端上游序列轉(zhuǎn)錄活性的影響。
　　 結(jié)果：
　　 1.獲得了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染有Tmub1 shRNA慢病毒載體的細(xì)胞系
　　 通過流式細(xì)胞儀篩選獲得轉(zhuǎn)染有Tmub1 shRNA慢病毒載體的細(xì)胞系命名為BRL-3A/256，轉(zhuǎn)染空載體的細(xì)胞作為陰性對(duì)照(命名為BRL-3A/Neg)，BRL-

10、3A/256細(xì)胞系中Tmub1表達(dá)被有效抑制。
　　 2.明確了IL-6體外誘導(dǎo)肝細(xì)胞增殖的最佳使用條件
　　 在IL-6的工作濃度為15ng/ml，誘導(dǎo)時(shí)間為12h的情況下，BRL-3A的[3H]-Tdr摻入率達(dá)到最高，在后續(xù)的試驗(yàn)中都采用該條件使用IL-6。
　　 3.IL-6能明顯上調(diào)大鼠肝細(xì)胞內(nèi)Tmub1的表達(dá)
　　 在IL-6誘導(dǎo)肝細(xì)胞增殖的過程中，IL-6能使大鼠肝細(xì)胞中Tmub1的mRNA和

11、蛋白水平都顯著升高(p<0.05)，而且IL-6誘導(dǎo)能夠部分逆轉(zhuǎn)shRNA慢病毒載體對(duì)Tmub1表達(dá)的抑制作用(p<0.05)。
　　 4.抑制Tmub1表達(dá)對(duì)肝細(xì)胞增殖有促進(jìn)作用
　　 在不使用重組IL-6對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理的條件下，抑制Tmub1表達(dá)可使BRL-3A/256細(xì)胞的[3H]-TdR摻入率明顯高于BRL-3A和BRL-3A/Neg組細(xì)胞(P<0.05)；加入IL-6誘導(dǎo)后這種現(xiàn)象仍然存在，而且這種差異更加明顯

12、(P<0.05)。
　　 5.大鼠肝細(xì)胞內(nèi)存在Tmub1和CAML的相互作用
　　 激光共聚焦實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)鼠肝細(xì)胞內(nèi)Tmub1和CAML蛋白均有表達(dá)，共定位于肝細(xì)胞漿中；免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)證實(shí)，Tmub1和CAML能在肝細(xì)胞中發(fā)生結(jié)合；抑制Tmub1表達(dá)可使大鼠肝細(xì)胞內(nèi)CAML蛋白含量增加，同時(shí)肝細(xì)胞鈣離子內(nèi)流也增強(qiáng)。
　　 6.Tmub1基因5’端上游序列中存在多個(gè)肝再生相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子潛在結(jié)合位點(diǎn)
　　 Tmub

13、1基因5’端上游-2007～+50之間序列中存在多個(gè)和肝再生相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子潛在結(jié)合位點(diǎn)，包括5個(gè)C/EBP結(jié)合位點(diǎn)、3個(gè)AP-1結(jié)合位點(diǎn)、1個(gè)STAT結(jié)合位點(diǎn)、2個(gè)CREB結(jié)合位點(diǎn)。
　　 7.獲得了大鼠Tmub1基因5’端上游基因刪除片段螢光素酶報(bào)告基因載體
　　 構(gòu)建了含-2008～+50、-1734～+50、-1637～+50、-1559～+50、-1392～+50、-1267～+50、-876～+50、-679～

14、+50、-467～+50、-273～+50、-152～+50、-57～+50等12個(gè)刪除片段的螢光素酶報(bào)告基因載體(分別命名為T1-T12)，各載體經(jīng)MluI和XhoI雙酶切、PCR擴(kuò)增并測(cè)序鑒定后確定載體構(gòu)建正確。
　　 8.Tmub15’端上游-2008～+50序列有明顯的轉(zhuǎn)錄活性
　　 所構(gòu)建的報(bào)告基因載體的螢光素活性均明顯高于對(duì)照組(P<0.05)，提示-2008～+50序列有明顯的轉(zhuǎn)錄活性。其中除托T4、T6載

15、體外，其余各刪除序列轉(zhuǎn)錄活性總體呈依次下降趨勢(shì)。
　　 9.IL-6能明顯增強(qiáng)Tmub1基因啟動(dòng)子區(qū)的轉(zhuǎn)錄活性
　　 加入IL-6的誘導(dǎo)后，除轉(zhuǎn)染T5、T6載體的細(xì)胞外外，其余各組細(xì)胞的螢光素酶活性都顯著升高(P<0.05)，提示IL-6能增強(qiáng)Tmub1基因轉(zhuǎn)錄。根據(jù)各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞螢光素酶差異情況分析，刪除C/EBPβ、STAT3、AP-1等轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)所在的序列可使Tmub1啟動(dòng)子區(qū)序列的轉(zhuǎn)錄活性明顯下降。
　

16、　 10.大鼠肝細(xì)胞內(nèi)C/EBPβ和Tmub1表達(dá)正相關(guān)
　　 采用siRNA抑制BRL-3A內(nèi)C/EBPβ表達(dá)后，Tmub1的表達(dá)水平也明顯下降(p<0.05)，提示C/EBPβ和Tmub1的表達(dá)正相關(guān)。
　　 11.構(gòu)建了C/EBPβ過表達(dá)載體
　　 在pCMVTag2B載體中插入大鼠C/EBPβ全表達(dá)序列，獲得載體經(jīng)BamHIU和XhoI雙酶切、PCR擴(kuò)增并測(cè)序鑒定后確定載體構(gòu)建正確，并命名為pCMVTa

17、g2B-C/EBP。
　　 12.C/EBPβ能顯著增強(qiáng)Tmub1基因啟動(dòng)子區(qū)的轉(zhuǎn)錄活性
　　 將pCMVTag2B-C/EBP載體與Tmub1基因螢光素酶報(bào)告基因載體共轉(zhuǎn)染入BRL-3A細(xì)胞后，除轉(zhuǎn)染T6載體的細(xì)胞外外，其余各組細(xì)胞的螢光素酶活性都明顯增加，說明C/EBPβ能顯著增加Tmub1基因的轉(zhuǎn)錄。T2較T1，T11較T10，T12較T11載體螢光素酶活性下降幅度最大，提示C/EBPβ增強(qiáng)Tmub1基因轉(zhuǎn)錄可能和

18、-2008～-1735、-273～-153及-152～-58序列有關(guān)。
　　 結(jié)論：
　　 1.Tmub1可抑制大鼠肝細(xì)胞增殖，在肝再生過程中可能發(fā)揮負(fù)向調(diào)控作用。
　　 2.增殖的肝細(xì)胞中存在Tmub1和CAML的相互作用，Tmub1可能通過參與CAML蛋白的降解并影響鈣離子內(nèi)流來抑制肝細(xì)胞增殖。
　　 3.IL-6可能通過激活C/EBPβ、STAT3、AP-1等下游轉(zhuǎn)錄因子來增強(qiáng)Tmub1的表達(dá)。