miRNAs在急性肝衰竭小鼠中的表達譜及其對肝細胞凋亡的調(diào)控作用研究.pdf

1、背景與目的
　　急性肝衰竭(acute liver failure,ALF)是由多種原因引起的嚴重肝臟損害,其合成、解毒、排泄和生物轉化等功能嚴重障礙或失代償,出現(xiàn)以凝血機制障礙和黃疸、肝性腦病和腹水等為主要表現(xiàn)的一組臨床癥候群。病情進展迅速,病死率高達80％,嚴重威脅人們健康。在中國等發(fā)展中國家,嗜肝病毒感染尤其是乙型肝炎病毒(HBV)感染則是最主要的原因。肝衰竭的發(fā)病機制迄今尚不清楚,治療仍為臨床上的一大難點。了解肝衰竭的發(fā)病

2、機制可為臨床早期診斷提供新的分子生物學指標,為臨床治療提供新的治療方向及作用靶點。
　　微小RNA(micmRNA,miRNA)是一類內(nèi)源性非編碼調(diào)控單鏈小分子RNA,長度約為18～24個核苷酸。在人類基因組中已發(fā)現(xiàn)超過500個miRNA編碼基因,預測可調(diào)控約5300個基因。miRNA主要與靶mRNA的3'UTR結合,引起靶mRNA沉默,起負調(diào)控作用。近年來,miRNA的研究是國際上的一大熱點,其原因是這些普遍存在的小分子在真核基

3、因表達調(diào)控中有著廣泛的作用,盡管對miRNA的研究還處于初級階段,據(jù)推測miRNAs在高級真核生物體內(nèi)對基因表達的調(diào)控作用可能和轉錄因子一樣重要,miRNA可能代表在一個新發(fā)現(xiàn)的層次上的基因表達調(diào)控方式。
　　生物信息學方法數(shù)據(jù)庫如GO(Gene ontology)和KEGG(KyotoEncyclopedia of Genes and Genomes)可有效地預測復雜的細胞生物功能及信號通路。生物信息學已被成功應用于miRNA在

4、心臟疾病和肝纖維化中功能的預測研究之中。
　　目前miRNAs在ALF中的表達譜以及miRNA與肝細胞凋亡之間的關系尚不清楚。在本實驗中,我們利用ALF小鼠模型深入研究了miRNAs在ALF中的表達譜及其對肝細胞凋亡調(diào)控的分子機制。
　　方法
　　1.急性肝衰竭小鼠模型的建立及miRNA表達譜的研究:目的是用D-GalN/LPS聯(lián)合誘導小鼠建立急性肝衰竭模型,為研究miRNA在急性肝衰竭中的調(diào)控作用提供穩(wěn)定、可靠的動物

5、模型。BALB/C小鼠,隨機分為四組,以D-氨基半乳糖(D-GalN,900mg/kg)聯(lián)合脂多糖(LPS,10μg/kg)腹腔注射建立急性肝衰竭為實驗組,對照組分別予以D-GalN900mg/kg、LPS10μg/kg以及生理鹽水,在不同時間點觀察小鼠死亡率,給藥后0、1、3、5、7、9小時分別留取小鼠血清、肝臟組織標本。H&E染色檢測肝臟病理學變化,免疫組化方法檢測肝臟肝細胞凋亡,ELISA方法檢測血清中炎癥因子的表達,生化分析儀檢

6、測血清中ALT、AST水平。miRNA micmarray檢測小鼠肝臟microRNA的表達譜。
　　2.miRNAs在急性肝衰竭小鼠中調(diào)控作用的生物信息學分析:基于microarray結果,對在急性肝衰竭中持續(xù)發(fā)生變化(上調(diào)或下調(diào))的miRNAs進行生物信息學分析。以便深入了解miRNAs在肝衰竭中具體的調(diào)控作用。利用基因本體論(GO)方法對基因進行顯著性的功能分析,從而得到顯著性的GO。由顯著性GO與基因的關系,及microR

7、NA與基因的關系,就可以得到miRNA與顯著性的GO之間的關系。KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes orthology)信號通路分析是對基因參與的所有信號通路進行顯著性的分析,根據(jù)miRNAs和基因的關系,從而得到miRNAs在信號通路中的調(diào)控作用。同時我們用差異miRNAs調(diào)控的基因與miRNA的屬性關系來建立miRNA-gene作用網(wǎng)絡
　　3.miR-15b/16在急性肝

8、衰竭肝細胞凋亡中的調(diào)控作用研究:D-GalN(1 mg/m1)聯(lián)合TNF(100 ng/m1)體外誘導小鼠胚胎肝細胞BNLCL2凋亡,流式細胞分析細胞凋亡。RT-PCR檢測miR-15b/16及TNF在凋亡細胞中的表達,利用miR-15b/16阻遏物(inhibitor)轉染細胞,進一步研究miR-15b/16對引起肝細胞凋亡的中心因子TNF以及抗凋亡因子BCL2的調(diào)控作用。
　　結果：
　　1.D-GalN/LPS給藥后5

9、h小鼠開始死亡,9h死亡率為50％,24小時死亡率達80％,而對照組無一例死亡。肝組織在病變早期(3小時前)肝臟點狀出血,5小時肝組織炎癥加重,肝小葉結構紊亂,大量炎性細胞浸潤,可見肝細胞凋亡的發(fā)生,晚期(7小時后)可見大量肝細胞壞死,整個肝臟淤血,無肝小葉結構。給藥1小時ALT和AST無明顯變化,1小時后表達開始上升,7小時達到高峰(和對照組比較P＜0.01),7小時后因肝細胞大量壞死,血清中ALT、AST水平急驟下降。血清中TNF-

10、a和IL-6的表達水平和肝臟中mRNA的水平基本一致,正常小鼠體內(nèi)微量表達TNF-a和IL-6,為機體正常發(fā)育生長所必需,D-GalN/LPS誘導后其表達均發(fā)生了變化,給藥后血清中TNF-a和肝臟TNF-a mRNA水平均表達上調(diào)(和0小時相比各時間點差異均具有統(tǒng)計學意義,p＜0.05),其中1小時上升達到一個高峰(p＜0.01),7小時再次達到一個高峰(p＜0.01);IL-6發(fā)生了與TNF-a類似的變化。為了明確miRNA在急性肝衰

11、竭中表達及可能發(fā)揮的作用,采用基于LNA技術的miRNAmicroarray分析發(fā)現(xiàn),在急性肝衰竭體內(nèi)有122個miRNAs發(fā)生了變化,95個miRNAs變化明顯(P＜0.01)。
　　2.基于microarray結果分析得到,急性肝衰竭模型組給藥后95個miRNAms發(fā)生顯著變化,其中5小時和7小時均發(fā)生上調(diào)的有20個,下調(diào)的有26個,49個miRNAs變化波動。為了進一步明確變化miRNAs在急性肝衰竭哪些信號通路中發(fā)揮作用及

12、其對哪些功能進行調(diào)控,我們對5小時和7小時均發(fā)生上調(diào)和下調(diào)的miRNAs進行生物信息學基因本體論(GO,Gene Ontology)分析,基于KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genesand Genomes)數(shù)據(jù)庫對其靶基因進行信號通路(pathway)分析,結果發(fā)現(xiàn),59個GO發(fā)生顯著性變化,包括:apoptosis,anti-apoptosis,immuneresponse,protein kinase cas

13、cade,cell cycle,cell adhesion,intracellularsignalling cascade,TGF-receptor signalling pathway and DNA repair等,而MAPK signalling pathway,cell cycle,cytokine-cytokine receptor interactionand apoptosis等信號通路則具有較高的富集值。
　　根據(jù)

14、以上GO和KEGG生物信息學分析結果構建miRNA-mRNA網(wǎng)絡圖,結果發(fā)現(xiàn)上調(diào)的miRNAs如miR-15b,-16,-155,-21,-125a/b-5p,-26b和下調(diào)的miRNAs如miR-466f-3p,-467f,-574-5p,-93,-1187,-145,Let-7b,-329 and-24和凋亡相關。
　　3.從microarray數(shù)據(jù)和生物信息學結果發(fā)現(xiàn),miRNAs在凋亡通路中發(fā)揮重要的調(diào)控作用,而miR-1

15、5b/16共同作用于凋亡基因BCL2。Luciferase和westem-blot進一步驗證生物信息學結果得到BCL2為miR-15b/16的靶基因。體外模擬體內(nèi)小鼠肝衰竭誘導條件,利用D-GalN/TNF誘導肝胚胎細胞BNLCL2凋亡過程中發(fā)現(xiàn),miR-15b/16表達上調(diào),體外用miR-15b/16阻遏物(inhibitor)可有效減輕肝細胞凋亡,降低細胞內(nèi)TNF-a mRNA的表達,細胞上清液中TNF-a的含量也隨之下降,而細胞中