Prohibitin在人永生化表皮HaCaT細胞凋亡過程中的表達及其調(diào)控作用研究.pdf

1、本論文以姜黃素誘導HaCaT細胞凋亡為基礎,運用亞細胞蛋白質(zhì)組學技術對HaCaT細胞凋亡前后核基質(zhì)蛋白組成變化進行系統(tǒng)分析,發(fā)現(xiàn)了細胞凋亡過程中的特異核基質(zhì)蛋白Prohibitin(PHB)表達下調(diào),并以此為目標蛋白,對其在HaCaT細胞中的表達與定位及其與相關癌基因、抑癌基因產(chǎn)物的共定位及相互作用關系進行了研究。探索PHB在HaCaT細胞凋亡過程中的調(diào)控作用,以期能夠揭示PHB在人永生化表皮HaCaT凋亡過程中的分子調(diào)控網(wǎng)絡,從而找出

2、深入探索表皮細胞凋亡的研究方向。
　　 實驗結(jié)果顯示,經(jīng)7.5mg/L姜黃素誘導處理之后,人永生化表皮HaCaT細胞的增殖活動明顯受到抑制,細胞體積縮小、細胞核固縮、核內(nèi)染色質(zhì)凝聚;瓊脂糖凝膠電泳出現(xiàn)細胞凋亡典型的DNA“梯狀”條帶;而且與細胞凋亡相關基因p53、rb、c-myc、bcl-2等表達下調(diào),抑癌基因:fas、bax等表達上調(diào)。HaCaT細胞凋亡前后的核基質(zhì)蛋白的雙向電泳和質(zhì)譜分析共鑒定了21種表達差異核基質(zhì)蛋白,其中

3、PHB表達下調(diào)。Western blotting實驗證明,HaCaT細胞凋亡過程中PHB在核基質(zhì)蛋白中表達下調(diào)而全細胞蛋白水平表達上調(diào)。激光共聚焦顯微鏡觀察顯示PHB在HaCaT細胞中分別與Fas、c-Myc、P53、Rb、Bax和Bcl-2等蛋白具有或強或弱的共定位關系,凋亡處理后其共定位區(qū)域發(fā)生了相應變化。本研究成功構(gòu)建PHB原核表達載體pGEX-4T-2-phb,并在重組蛋白可溶性誘導表達及純化基礎上,利用GST pull-dow

4、n實驗進一步證實在HaCaT細胞中,PHB分別與c-Myc、P53和Bax有直接相互作用關系。真核表達載體pEGFP-Cl-phb的構(gòu)建及真核細胞轉(zhuǎn)染結(jié)果,證明了PHB在HaCaT細胞凋亡過程中的定位及其轉(zhuǎn)位變化。
　　 研究結(jié)果表明,7.5mg/L姜黃素能顯著誘導人永生化表皮HaCaT細胞的凋亡,并能通過干預人永生化表皮HaCaT細胞凋亡相關基因的活性,改變多種與基因表達調(diào)控和細胞信號轉(zhuǎn)導相關的重要核基質(zhì)蛋白的表達,其中PHB

5、為誘導多種細胞凋亡后出現(xiàn)的共同差異核基質(zhì)蛋白。本研究發(fā)現(xiàn)PHB與凋亡相關基因bax、bcl-2、fas、p53、c-myc和rb的蛋白產(chǎn)物均存在不同程度的共定位關系并在HaCaT細胞凋亡過程中分別出現(xiàn)定位和轉(zhuǎn)位變化的現(xiàn)象,而且GST pull-down實驗證明了PHB與c-Myc、P53和Bax存在直接的相互作用關系。由此證實姜黃素誘導人永生化表皮HaCaT細胞凋亡與核基質(zhì)的表達變化是密不可分的,特異核基質(zhì)蛋白PHB通過與其具有相互作用