殼聚糖-硬脂酸嫁接物-蛋白質(zhì)-DNA三元復(fù)合物基因給藥系統(tǒng)研究.pdf

1、殼聚糖-硬脂酸嫁接物膠束具有較強的腫瘤細(xì)胞攝取能力和細(xì)胞核轉(zhuǎn)運功能，其陽離子特性可有效密接質(zhì)粒DNA，實現(xiàn)有效的基因轉(zhuǎn)染和體內(nèi)外抗腫瘤療效。前期研究結(jié)果表明：殼聚糖-硬脂酸嫁接物膠束負(fù)載基因藥物進入靶細(xì)胞后，基因藥物的有效釋放是制約其基因轉(zhuǎn)染效率的主要因素。本研究為實現(xiàn)基因藥物在靶細(xì)胞內(nèi)的有效釋放，構(gòu)建殼聚糖-硬脂酸嫁接物/蛋白質(zhì)/質(zhì)粒DNA三元基因給藥系統(tǒng)，考察蛋白質(zhì)的等電點對其基因轉(zhuǎn)染效率的影響。
　　 采用酶解法制備低分子

2、量的殼聚糖(chitosan，CS)，以碳二亞胺(EDC)為交聯(lián)耦合劑，合成殼聚糖-硬脂酸嫁接物(stearic acid grafted chitosan，CS-SA)。核磁共振氫譜確證嫁接物的化學(xué)結(jié)構(gòu)；三硝基苯磺酸法測定氨基取代度；芘熒光法測定臨界膠束濃度；動態(tài)光散射法測定嫁接物膠束的粒徑；透射電鏡觀察膠束的形態(tài)學(xué)特征。采用乙酰氯催化法酯化牛血清白蛋白(BSA)合成不同等電點的BSA，Zeta電位法測定等電點。分別制備CS-SA/D

3、NA二元復(fù)合物和含有不同等電點蛋白質(zhì)的CS-SA/BSA/DNA三元復(fù)合物。測定二元、三元復(fù)合物的粒徑并觀察復(fù)合物的形態(tài)；凝膠電泳分析嫁接物膠束與DNA的密接程度。以pEGFP-C1作為報告基因，HEK293細(xì)胞為模型細(xì)胞，熒光倒置顯微鏡觀察綠色熒光蛋白表達(dá)，流式細(xì)胞儀測定轉(zhuǎn)染效率，比較二元復(fù)合物及三元復(fù)合物的轉(zhuǎn)染差異；激光共聚焦比較二元、三元復(fù)合物的細(xì)胞攝取及胞內(nèi)釋放行為，流式細(xì)胞儀定量攝取效果；MTT法考察給藥系統(tǒng)的細(xì)胞毒性。本研究

4、進一步以survivin為靶點，設(shè)計并合成shRNA重組質(zhì)粒(pshSUR)。建立實時熒光定量PCR方法，篩選最佳干擾質(zhì)粒；采用最佳轉(zhuǎn)染處方制備干擾RNA給藥系統(tǒng)CS-SA/BSA/pshSUR，并以人乳腺癌藥物敏感細(xì)胞(MCF-7)和耐藥細(xì)胞(MCF-7/Adr)為模型細(xì)胞，考察基因治療聯(lián)合化療藥物紫杉醇給藥后，逆轉(zhuǎn)耐藥細(xì)胞MCF-7/Adr耐藥行為。
　　 研究結(jié)果表明，通過碳二亞胺介導(dǎo)得到了兩親性的殼聚糖-硬脂酸嫁接物(C

5、S-SA)。核磁共振氫譜確證了CS-SA的化學(xué)組成；所合成的CS-SA的氨基取代度為7.4％；臨界膠束濃度為81.0μg/L；濃度為1 mg/mL的嫁接物膠束數(shù)均粒徑為36.4±0.9 nm，電位為32.7±1.2 mV；透射電子顯微鏡結(jié)果顯示膠束呈球形，粒徑較小，分布均一。
　　 嫁接物膠束具有較強的密接DNA能力，所形成的CS-SA/DNA二元復(fù)合物，粒徑較小且分布均一。通過乙酰氯催化法合成了等電點分別為4.7、6.0、9.

6、3的BSA，采用共孵育法制備CS-SA/BSA/DNA三元復(fù)合物。結(jié)果表明：當(dāng)WBSA/WCS-SA比由0.1增至0.5時，嫁接物仍可有效密接DNA。當(dāng)BSA含量較低時，三元復(fù)合物與二元復(fù)合物相比較粒徑差異不是很明顯均小于200 nm，且不影響細(xì)胞攝??；體外基因轉(zhuǎn)染結(jié)果顯示：BSA的等電點顯著影響嫁接物介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染效率。與二元復(fù)合物相比，CS-SA/BSA(6.0)/DNA三元復(fù)合物的基因轉(zhuǎn)染效率略有增加；CS-SA/BSA(4.7)

7、DNA轉(zhuǎn)染效果進一步增加，且接近陽性LipofectamineTM2000對照；而CS-SA/BSA(9.3)/DNA對轉(zhuǎn)染效率起抑制作用。采用等電點為4.7的BSA促進基因轉(zhuǎn)染的效率，在于其負(fù)電荷性質(zhì)促進基因藥物的釋放。
　　 本研究建立了準(zhǔn)確可靠的實時熒光定量PCR(RT-PCR)方法學(xué)，并采用RT-PCR技術(shù)篩選出最佳干擾質(zhì)粒。以三元復(fù)合給藥系統(tǒng)基因治療結(jié)合紫杉醇的化療研究結(jié)果表明，經(jīng)基因治療后可有效增加耐藥細(xì)胞MCF-7