可改善蛋白質(zhì)和核酸類(lèi)藥物功效的殼聚糖衍生物納米給藥系統(tǒng).pdf

1、通過(guò)自由基共聚合反應(yīng),修飾殼聚糖的氨基并制備一系列新型殼聚糖衍生物納米粒。以胰島素、DNA乙肝疫苗和蛋白質(zhì)乙肝疫苗為模型藥物,研究殼聚糖衍生物納米粒的理化性質(zhì)、載藥特點(diǎn)、體外釋藥規(guī)律、體內(nèi)遞藥及改善藥物功效等特性。
　　 1、甲基丙烯酸衍生物共聚物納米粒的制備和表征
　　 運(yùn)用自由基聚合法將疏水性的甲基丙烯酸甲酯(MMA)分別與親水性的甲基丙烯酸(MAA)、異丙基丙烯酰胺(NIPAAm)、甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化銨(T

2、MAEMC)和甲基丙烯酸二甲基氨基乙酯(DMAEMC)共聚合,制得疏水核心、親水表面的兩親性納米粒,對(duì)納米粒的粒徑、表面電荷和抑酶作用等進(jìn)行表征。結(jié)果表明納米粒粒徑較小、分布均一,穩(wěn)定性較高,對(duì)蛋白酶活性有一定的抑制作用。通過(guò)考察反應(yīng)時(shí)間、親水聚合物單體濃度、聚合單體總濃度、引發(fā)劑濃度、離子強(qiáng)度和pH值對(duì)納米粒粒徑大小和表面電荷的影響,確定制備工藝。
　　 2、殼聚糖衍生物納米粒的制備和表征
　　 運(yùn)用自由基聚合反應(yīng)原理

3、,在殼聚糖的氨基位接枝季銨鹽等活性基團(tuán),共聚合產(chǎn)生的接枝共聚物在水中自發(fā)形成疏水核心、親水表面的兩親性納米粒。紅外光譜(FTIR)1652cm-1處吸收峰的消失和1637cm-1處新的吸收峰的出現(xiàn)、核磁共振(1H-NMR)δ=3.2ppm質(zhì)子化學(xué)位移峰的出現(xiàn),均表明TMAEMC的季銨(-N+(CH3)3)基團(tuán)已連接至殼聚糖氨基。納米粒粒徑分布均一、表面電位較強(qiáng)(大于15mV)、穩(wěn)定性較高。
　　 3、殼聚糖衍生物納米粒用于胰島素

4、的口服給藥
　　 以殼聚糖-甲基丙烯酸甲酯(CM)、殼聚糖-甲基丙烯酸二甲基氨基乙酯-甲基丙烯酸甲酯(CDM)和殼聚糖-甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化銨-甲基丙烯酸甲酯(CTM)納米粒為給藥載體,胰島素為模型藥物,對(duì)載胰島素納米粒的包封率、體外釋放、降血糖效果等分別進(jìn)行考察。胰島素通過(guò)與納米粒表面的正電荷親水鏈之間的離子相互作用包載至納米粒,包封率隨納米粒濃度的增加而升高;胰島素的釋放是通過(guò)其在納米粒表面親水鏈的解離擴(kuò)散實(shí)現(xiàn)的,釋放

5、速率由胰島素和親水鏈間相互作用力的大小決定;上述三種納米粒中,CTM納米粒的表面電荷較高,與胰島素的離子相互作用力較大,故胰島素的解離和釋放速率較慢。圓二色譜測(cè)定結(jié)果表明納米粒對(duì)胰島素的包載不會(huì)對(duì)其高級(jí)結(jié)構(gòu)造成顯著影響。
　　 采用大鼠口服和十二指腸給藥方式分別考察載胰島素納米粒的降血糖效果?？诜o藥試驗(yàn)中,載胰島素的CM、CDM和CTM納米粒均有一定程度的降血糖作用。給藥(100u·kg-1)2h后,血糖開(kāi)始下降,8h至10h

6、血糖值降至最低,CM、CDM和CTM納米粒給藥組的血糖值分別約為初始值的80％、75％和65％。十二指腸給藥1h后,血糖開(kāi)始下降,4h左右血糖值降至最低,CTM納米粒給藥組的給藥劑量為50u·kg-1和100u·kg-1時(shí),最低血糖值分別約為初始值的72％和65％。上述兩種給藥方式中,胰島素PBS對(duì)照組均無(wú)明顯的降血糖作用。采用口服給藥考察載胰島素CTM納米粒對(duì)糖尿病模型大鼠的降血糖效果,給藥劑量為100u·kg-1時(shí),給藥2h后血糖值

7、降至初始值的25％左右,試驗(yàn)結(jié)果表明,載胰島素CTM納米?？娠@著降低糖尿病模型大鼠的血糖水平,降血糖效果隨胰島素給藥劑量的增高而逐漸增強(qiáng)。
　　 4、殼聚糖衍生物納米粒用于提高乙型肝炎核酸疫苗免疫原性
　　 以聚甲基丙烯酸甲酯-甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化銨(TM)、CM、CDM和CTM納米粒為給藥載體,pVAX(HBc)為模型疫苗,測(cè)定載DNA疫苗納米粒誘導(dǎo)機(jī)體體液、細(xì)胞免疫的能力。DNA疫苗不需經(jīng)有機(jī)溶劑處理、超聲、劇

8、烈攪拌等過(guò)程即可包載至納米粒。與空白納米粒相比,DNA納米粒具有暗色的外殼和淡色的核心部分,粒徑略微增大,表明DNA已結(jié)合至納米粒表面的親水鏈,形成核心.外殼結(jié)構(gòu)。CM、TM、CDM和CTM納米粒對(duì)脫氧核糖核酸酶Ⅰ的活性都有一定的抑制作用,其中CTM納米粒的抑制作用最強(qiáng),與脫氧核糖核酸酶Ⅰ培育10min后,酶活力下降為初始值的32.2％。體內(nèi)免疫試驗(yàn)表明,CDM和CTM納米粒免疫組可有效提高特異性抗體的表達(dá)量、IFN-γ分泌量及CTL細(xì)

9、胞的殺傷毒性。
　　 5、殼聚糖衍生物納米粒用于蛋白質(zhì)乙肝疫苗給藥
　　 以TM、CDM和CTM納米粒為給藥載體,乙肝病毒核心抗原(hepatitis B virus core protein,HBCM)為模型疫苗,HLA-A2.1轉(zhuǎn)基因小鼠為模型動(dòng)物,對(duì)納米粒提高重組蛋白疫苗的體內(nèi)免疫水平和相關(guān)作用機(jī)理進(jìn)行研究。HBCM的等電點(diǎn)為5.1,在PBS(pH7.4)溶液中帶有明顯的負(fù)電荷,可被帶正電荷的納米粒吸附,包載至納米

10、粒的親水鏈之間。當(dāng)納米粒和HBCM的濃度為10mg·ml-1和50μg·ml-1時(shí),TM,CDM和CTM納米粒對(duì)HBCM的包封率分別為85.7％,94.2％和96.9％。與空白納米粒相比,載HBCM納米粒形成核-殼結(jié)構(gòu),粒徑略微增大,表明HBCM已被納米粒表面的親水鏈包載。共聚焦顯微觀察試驗(yàn)結(jié)果表明,納米粒可促進(jìn)蛋白質(zhì)被RAW264.7細(xì)胞吸收,并影響其在細(xì)胞內(nèi)的分布。體液和細(xì)胞免疫研究結(jié)果表明,載HBCM殼聚糖衍生物納米粒可顯著提高蛋

11、白質(zhì)疫苗的免疫原性,包括增加特異性抗體的含量和分泌細(xì)胞的數(shù)量,提高CTL細(xì)胞毒性和特異性CD8+T細(xì)胞的比例。
　　 6、PEG修飾的殼聚糖季銨鹽的制備、表征及其在DNA疫苗給藥中的應(yīng)用
　　 通過(guò)PEG修飾技術(shù),制得三甲基銨殼聚糖-mPEG(TMC-mPEG);帶正電荷的TMC-mPEG與帶負(fù)電荷的DNA疫苗通過(guò)靜電相互作用自組裝形成穩(wěn)定的納米復(fù)合物,考察其在體液和細(xì)胞免疫方面的作用。TMC由殼聚糖和TMAEMC經(jīng)自由

12、基引發(fā)劑的催化共聚合而成。mPEG-羧酸能與N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)和N,N'-二環(huán)己基碳二亞胺(DCCI)反應(yīng),生成酯化的mPEG衍生物(mPEG-SCM)。mPEG活化后,其親電基團(tuán)能與TMC的親核性氨基連接,生成TMC-mPEG共聚物。核磁共振δ=3.2ppm三甲基銨(-N+(CH3)3)和δ=3.3ppm甲基氧(CH3O-)的質(zhì)子化學(xué)位移峰的出現(xiàn),表明三甲基銨和mPEG已連接至殼聚糖的主鏈。殼聚糖的三甲基銨化程度為46.2％

13、,mPEG化的程度為36.9％。
　　 調(diào)整共聚物與pVAXq(HBc)的比例可制得不同粒徑和包封率的DNA疫苗納米粒。當(dāng)TMC-mPEG與pVAX(HBc)為5:1時(shí),制得的納米粒較穩(wěn)定,30d內(nèi)無(wú)凝聚物或沉淀物產(chǎn)生,平均粒徑為215.1±6.4nm,包封率為92.0％。體液和細(xì)胞免疫研究結(jié)果表明,載DNA疫苗TMC和TMC-mPEG免疫組均能顯著提高小鼠特異性抗體的含量和分泌細(xì)胞的數(shù)量。考慮到TMC具有一定程度的細(xì)胞毒性,生

14、物相容性較好的TMC-mPEG共聚物有望成為較優(yōu)的DNA疫苗載體。
　　 7、殼聚糖共聚物的安全性評(píng)價(jià)
　　 研究納米?；蚬簿畚锏募?xì)胞毒性、血液相容性、對(duì)肌肉組織的損傷、對(duì)小腸組織及細(xì)胞的損傷、急性毒性等,從細(xì)胞、組織及整體動(dòng)物水平考察相關(guān)材料的安全性。細(xì)胞存活率和血液相容性隨納米?；蚬簿畚锏臐舛群捅砻骐姾傻脑黾佣饾u降低。TMC-mPEG顯示較低的細(xì)胞毒性和溶血率,濃度為800μg·ml-1時(shí),細(xì)胞存活率可達(dá)90％;濃