類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑膜細(xì)胞表達(dá)survivin的研究.pdf

1、目的：尋求類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)滑膜細(xì)胞分離培養(yǎng)快速有效的方法，為類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎滑膜細(xì)胞體外研究提供方便有效的途徑；初步探討survivin對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎發(fā)生發(fā)展的作用，對(duì)滑膜細(xì)胞增殖影響的機(jī)制。 方法：用組織塊法、單膠原酶消化法、單胰酶消化法和雙酶消化法四種方法分離、培養(yǎng)20例RA滑膜細(xì)胞，取其培養(yǎng)第七日細(xì)胞計(jì)數(shù)，取第四代細(xì)胞鑒定，免疫組化鑒定細(xì)胞，測(cè)定分離細(xì)胞的數(shù)量和純度。8例正常(半月板損傷患者)滑膜細(xì)胞依上述方法培養(yǎng)鑒

2、定。將20例RA滑膜細(xì)胞及8例正?；ぜ?xì)胞分為四組：甲氨喋呤(MTX)處理組、三氧化二申(AS2O3)處理組、空白對(duì)照組和正?；ぜ?xì)胞對(duì)照組；觀察處理不同時(shí)間點(diǎn)0h、24h、48h細(xì)胞狀態(tài)，并提取總RNA行RT-PCR檢測(cè)各組survivin及caspase-3 mRNA表達(dá)。用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。 結(jié)果： 1.20例RA滑膜標(biāo)本培養(yǎng)結(jié)果顯示組織塊法較其余三種方法有效率高，依次為組織塊法>雙酶消化法>單

3、胰酶法>單膠原酶法。以細(xì)胞分離所需主要操作時(shí)間為準(zhǔn)，四種方法耗時(shí)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異有顯著性(方差分析，<0.05)，單膠原酶法>雙酶消化法>組織塊法>單胰酶法。隨機(jī)選取每種方法培養(yǎng)第七日細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，levene檢驗(yàn)方差不齊，選擇Kruskal-Walls檢驗(yàn)，Chi-Square統(tǒng)計(jì)量為45.63，自由度為3，P<0.05，可認(rèn)為四種方法所得細(xì)胞數(shù)有差異；組織塊法及雙酶消化法所得細(xì)胞數(shù)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異無(wú)顯著性(P>0.05)，其余兩種方法得到的細(xì)胞

4、數(shù)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異亦無(wú)顯著性(P>0.05)，而后兩種方法得細(xì)胞數(shù)較前兩種方法為少，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異有顯著性(P<0.05)。組織塊培養(yǎng)原代細(xì)胞排列有極性，成放射狀排列。體外培養(yǎng)的RA及半月板損傷后正常人原代滑膜細(xì)胞體外培養(yǎng)3代以后：光鏡下細(xì)胞以長(zhǎng)梭形為主，兩極胞突細(xì)長(zhǎng)，末端多與臨近細(xì)胞連接并交織成網(wǎng)狀，核居中，圓形或橢圓形，核仁明顯。 2.細(xì)胞鑒定結(jié)果：隨機(jī)選取每種培養(yǎng)方法第4代RA滑膜細(xì)胞進(jìn)行免疫組化染色，結(jié)果顯示vimentin陽(yáng)性染

5、色主要位于胞質(zhì)，呈棕黃色；空白陰性對(duì)照組胞質(zhì)未著色。表達(dá)vimentin細(xì)胞陽(yáng)性計(jì)分>1者比例均>95％，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異無(wú)顯著性(P>0.05)。 3.細(xì)胞狀態(tài)及RT-PCR結(jié)果：在所選0h點(diǎn)、24h點(diǎn)、48h點(diǎn)分別觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)并測(cè)四組MTX處理組、AS2O3處理組、空白對(duì)照組及外傷后滑膜細(xì)胞對(duì)照組survivin及caspase-3表達(dá)：(1)可見(jiàn)隨時(shí)間向前推移，MTX處理組細(xì)胞形態(tài)有變化，但不明顯，少數(shù)細(xì)胞可見(jiàn)變圓或皺縮、漂

6、浮，細(xì)胞數(shù)目未見(jiàn)明顯增多；AS2O3處理組細(xì)胞形態(tài)變化較明顯，細(xì)胞多數(shù)變圓、皺縮、漂浮，核不清楚，細(xì)胞數(shù)目減少；空白對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)未見(jiàn)明顯變化，細(xì)胞數(shù)目增多較明顯；正常滑膜細(xì)胞對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)未見(jiàn)明顯變化，細(xì)胞數(shù)目未見(jiàn)明顯增多。(2)0h點(diǎn)可見(jiàn)前三組survivin及caspase-3表達(dá)，正?；ぜ?xì)胞組則未見(jiàn)表達(dá)。(3)0h點(diǎn)前三組survivin及caspase-3表達(dá)強(qiáng)度統(tǒng)計(jì)學(xué)無(wú)明顯差異(P>0.05)，隨時(shí)間向前推移，MTX處理組

7、survivirt表達(dá)逐漸減弱，caspase-3表達(dá)逐漸增強(qiáng)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；AS2O3處理組survivin表達(dá)減弱到消失，caspase-3表達(dá)先增強(qiáng)后減弱差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；空白對(duì)照組二者表達(dá)未見(jiàn)明顯變化，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；正?；ぜ?xì)胞對(duì)照組各時(shí)間點(diǎn)均未測(cè)得survivin及caspase-3表達(dá)。 結(jié)論： 1.四種方法體外培養(yǎng)可獲得生物學(xué)特性穩(wěn)定的RA滑膜成纖維樣滑

8、膜細(xì)胞系，其中組織塊法是細(xì)胞水平建立RA體外實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ统晒β矢叩姆椒?，單純胰酶法是?xì)胞水平建立RA體外實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ涂焖俚姆椒ā?2.在RA患者，survivin在滑膜成纖維樣滑膜細(xì)胞的表達(dá)增高，在正常細(xì)胞對(duì)照組則未見(jiàn)明顯表達(dá)。 3.Survivin抑制成纖維樣滑膜細(xì)胞凋亡促進(jìn)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎滑膜細(xì)胞大量增生導(dǎo)致關(guān)節(jié)侵蝕，進(jìn)一步分析：(1)survivn可能通過(guò)caspase途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；(2)MTX及AS2O3可能通過(guò)抑制