新型熒光探針檢測平臺的構(gòu)建及其在miRNA-21和UDG檢測中的應(yīng)用.pdf

1、近年來，熒光分子探針技術(shù)基于靈敏度高、特異性強(qiáng)、操作簡便等特點，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于化學(xué)、醫(yī)學(xué)和生物學(xué)等領(lǐng)域。本論文通過設(shè)計和合成多種靶向性新型分子信標(biāo)，在對其性能進(jìn)行研究的基礎(chǔ)上，將其應(yīng)用到復(fù)雜生物樣品中的靶分子定量檢測、分析，結(jié)合經(jīng)典分子生物學(xué)研究手段進(jìn)一步探討分子信標(biāo)在臨床生物大分子檢測和診斷中的潛在應(yīng)用價值。
　　本文的主要研究內(nèi)容如下：
　　1.分子信標(biāo)用于腫瘤相關(guān)的miRNA-21表達(dá)水平的快速、簡單檢測
　　本

2、章以根據(jù) miRNA-21序列組成設(shè)計合成可特異性識別 miRNA-21的分子信標(biāo)為工具，發(fā)展了一種基于分子信標(biāo)直接在總RNA中檢測miRNA-21的方法。在利用熒光波長掃描技術(shù)考察了分子信標(biāo)的熱穩(wěn)定性、雜交性能和特異性以及信標(biāo)與靶分子雜交條件優(yōu)化的基礎(chǔ)上，將該技術(shù)直接用于培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞和人胃癌組織中的miRNA-21表達(dá)水平檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：具有良好的雜交性能和特異性的分子信標(biāo)檢測標(biāo)準(zhǔn)樣品的下限可達(dá)到0.5 nM，能夠快速實現(xiàn)腫瘤細(xì)胞和

3、組織中的miRNA表達(dá)水平差異性檢測，結(jié)果表明：在17例標(biāo)本胃癌組織中有10例(59％) miRNA-21表達(dá)水平高于癌旁組織；檢測結(jié)果的可靠性進(jìn)一步通過qRT-PCR進(jìn)行驗證；此外，采用Western blotting對miRNA-21直接調(diào)控的目的基因PDCD4和PTEN表達(dá)水平進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)其蛋白表達(dá)與miRNA-21表達(dá)趨勢呈負(fù)相關(guān)。
　　2.基于分子信標(biāo)結(jié)合酶促信號放大用于miRNA-21的超靈敏檢測
　　本章目的

4、是利用設(shè)計和合成莖部為RNA的新型嵌合分子信標(biāo)建立一種基于雙重信號放大系統(tǒng)超靈敏檢測miRNA的新方法。在通過熒光法考察該分子信標(biāo)的穩(wěn)定性、抗酶切能力以及雜交條件的基礎(chǔ)上，以體外合成的標(biāo)準(zhǔn) miRNA-21為檢測對象，發(fā)現(xiàn)這種具有雙重信號放大功能的分子信標(biāo)檢測技術(shù)檢測下限可以達(dá)到1 pM，其靈敏度比純粹的分子信標(biāo)檢測法高3個數(shù)量級。進(jìn)一步用于胃癌組織樣品檢測結(jié)果表明：該方法可用于準(zhǔn)確檢測0.2μg總RNA中的miRNA-21表達(dá)水平。3

5、.基于分子信標(biāo)實時監(jiān)測UDG酶活性方法的建立及其應(yīng)用
　　本章以含有損傷堿基尿嘧啶的嵌合型分子信標(biāo)作為酶促底物和信號報告分子，建立一種 UDG酶的分析方法。通過實時熒光的方法來進(jìn)行 UDG酶的活性分析和對UDG酶的熱動力學(xué)進(jìn)行考察。結(jié)果表明UDG的檢測下限可以達(dá)到0.005 U/ml，UDG酶的KM和kcat值分別為0.89±0.1μM和210±10 min-1。接著將其用于UDG酶抑制劑的篩選，發(fā)現(xiàn)5-氟尿嘧啶和順鉑具有顯著 U