核酸探針的設計及其在疾病檢測和酶學研究中的應用.pdf

1、本文結合分子信標核酸探針和染料探針技術，建立了丙肝病毒核酶切割產(chǎn)物和限制性內(nèi)切酶切割產(chǎn)物的超靈敏檢測方法和簡便快捷的地中海貧血遺傳病點突變基因分型的方法；建立了體外監(jiān)測DNA復制過程聚合反應的熒光方法；探討了生命活動過程中有重要意義的連接酶的連接機理和聚合酶的活性實時分析。更重要的是，開發(fā)并研制了三種新型的核酸探針—核酶分子探針、熔點擴大核酸探針和信號擴增核酸探針，用于丙肝病毒核酶切割過程的實時監(jiān)測和地中海貧血遺傳病點突變的檢測。主要內(nèi)

2、容歸納如下： 1、建立了核酶切割產(chǎn)物的超靈敏檢測方法。核酶是具有切割特定RNA序列能力的小RNA分子，在抗病毒、抗惡性腫瘤基因治療中有著重要意義。目前核酶切割產(chǎn)物的研究方法，一般需要將核酶或底物RNA進行標記，不利于核酶臨床研究與應用。本論文利用分子信標作為核酶切割產(chǎn)物的連接模板和檢測分子，在RNA/DNA核酸雜合體連接過程中，核酶切割產(chǎn)物的信息被實時轉(zhuǎn)換為熒光信號。實現(xiàn)了在不標記核酶或RNA底物的情況下，高靈敏高特異地檢測丙肝

3、病毒核酶切割產(chǎn)物，檢測下限可達0.05 nmol/L。為真實準確反映核酶切割反應提供了一種簡便快捷的非同位素分析方法，也為核酶基因藥物的快速篩選、核酶動力學、核酶在基因治療中的深入研究提供了新的思路和技術。 2、建立了限制性內(nèi)切酶切割產(chǎn)物的超靈敏檢測方法。利用分子信標作為限制性內(nèi)切酶切割產(chǎn)物的連接模板和檢測探針，在DNA/DNA核酸雜合體連接過程中，將切割產(chǎn)物的信息實時轉(zhuǎn)換為熒光信號，實現(xiàn)了在不標記限制性內(nèi)切酶底物的情況下，高靈

4、敏高特異地檢測限制性內(nèi)切酶切割產(chǎn)物。其線性響應范圍為0.2 nmol/L到30nmol/L，檢測下限可達0.05 nmol/L。該方法不僅可用于限制性內(nèi)切酶切割產(chǎn)物的檢測，還可用于其它水解酶切割產(chǎn)物的檢測。 3、建立了DNA連接酶連接機理研究的新方法。核酸連接是生命科學中倍受關注的生命活動。其機理研究有助于進一步拓展核酸連接反應在疾病檢測、基因載體及核酸修飾與分析等方面的應用。利用分子信標作為核酸連接的模板和信號產(chǎn)生分予，研究了T4 D

5、NA連接酶的連接機理。為連接酶連接機理及其連接動力學過程研究提供了一種簡便快捷的方法。該方法不僅可用于T4 DNA連接酶機理研究，還可用于其它DNA連接酶及RNA連接酶的研究。 4、建立了體外監(jiān)測DNA復制過程中聚合反應的熒光方法。DNA復制是最基本的生命活動之一，其研究對于探討生命繁衍、生存與進化問題有重要意義。目前DNA復制的研究，一般采用放射性標記與凝膠電泳相結合的方法，操作復雜，不利于方便快捷地捕獲生命活動過程中的重要信

6、息。利用分子信標監(jiān)測DNA的體外連續(xù)復制和不連續(xù)復制過程，以熒光信號的方式直接方便地表征出復制過程中聚合反應的有關重要信息，避免了傳統(tǒng)的DNA復制分析方法中的放射性同位素標記、變性聚丙烯酰胺凝膠電泳等復雜操作。并利用該體系，建立了三種聚合酶的定量分析方法。 5、建立了簡便快速的聚合酶活性實時分析新方法。聚合酶作為生命活動過程中的一種重要的酶，目前已廣泛應用于基因測序，載體制備及基因克隆等方面。利用染料探針技術，建立了一種簡便快捷

7、地實時監(jiān)測聚合酶活性的方法，探討了三種抗腫瘤藥物對聚合酶活性的影響，為以聚合酶為作用靶標的抗腫瘤新藥的開發(fā)及篩選提供了一種新的思路。 6、建立了地中海貧血遺傳病點突變檢測的簡便方法。地中海貧血是一種常見的點突變性遺傳病，發(fā)展一種操作簡便、成本低廉的檢測方法對該遺傳病的普查及產(chǎn)前診斷有重要意義?；谌玖咸结樇夹g，結合聚合酶特異性延伸反應，發(fā)展了一種簡單、快速、成本低的單核苷酸多態(tài)性基因分型方法，并用于地中海貧血遺傳病點突變的基因分

8、型。 7、核酶分子探針的設計及其對丙肝病毒核酶切割過程的實時監(jiān)測。核酶切割反應的研究，一直使用傳統(tǒng)的放射性同位素標記與變性聚丙烯酰胺凝膠電泳相結合的方法，操作繁瑣復雜，并且不能實時、動態(tài)地提供核酶切割過程的信息。通過將核酶底物修飾，在其兩端分別加上6個堿基形成互補臂，構建了一種新的核酶分子探標，它將核酶切割反應的信息實時同步轉(zhuǎn)換為熒光信號，實現(xiàn)了丙肝病毒核酶切割過程的實時監(jiān)測。與已有研究方法比較，該方法是一種非同位素標記、高靈敏

9、高特異的核酶切割反應實時監(jiān)測方法。為核酶活性分析、核酶動力學研究提供新型有效的手段，也為核酶基因藥物的深入研究提供了新的方法和思路。 8、熔點擴大核酸探針的設計及其在點突變檢測中的應用。許多遺傳性疾病的發(fā)生發(fā)展與點突變密切相關，點突變的準確檢測對這些疾病的預防、臨床檢測和分子診斷有重大意義。目前基于熔點分析的方法對于基因型之間有顯著差異的點突變，能快速準確的檢測，但是對于一些基因型之間熔點差異較小的點突變，不能進行有效判斷?；?/p>

10、熒光共振能量轉(zhuǎn)移和連接酶技術，設計了一種新的核酸探針，用于顯著提高點突變不同基因型之間的熔點差異，實現(xiàn)了點突變準確快速的基因分型研究。利用該方法，成功實現(xiàn)了地中海貧血遺傳病兩種普遍存在的點突變CD17(A→T)和Ivs-2-654(C→T)的基因分型。該方法能對各種點突變類型進行檢測，具有良好的保真性，而且操作簡便，不需要離心、電泳、分離等復雜繁瑣的步驟，有望在臨床檢測和應用上發(fā)揮重要作用。 9、信號擴增核酸探針的設計及其在點突

11、變檢測中的應用。高靈敏的點突變檢測方法，目前一般是基于單分子檢測系統(tǒng)進行，昂貴的檢測裝置使其在臨床應用受到一定限制?；谖⑶蚋患夹g與連接酶鏈式反應擴增技術，發(fā)展了一種新的核酸探針來高靈敏、方便快捷的進行點突變檢測。樣品的基因型通過檢測微球上捕獲的熒光連接產(chǎn)物方便快速的獲得。該方法具有很高的靈敏度，能檢測到600個拷貝的靶序列。這種方法，不僅能對PCR擴增產(chǎn)物的點突變進行檢測，而且能直接以抽提的總DNA進行點突變檢測，再加上其操作簡便、