東亞飛蝗對(duì)有機(jī)磷殺蟲(chóng)劑的抗性及其機(jī)理研究.pdf

1、東亞飛蝗Locustamigratoriamanilensis(Meyen)是為害嚴(yán)重的農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)，有機(jī)磷殺蟲(chóng)劑是防治這一害蟲(chóng)使用較廣的殺蟲(chóng)劑，為了深入探討東亞飛蝗對(duì)有機(jī)磷殺蟲(chóng)劑的抗性機(jī)制，針對(duì)東亞飛蝗不同種群制定相應(yīng)的治理策略，更有效地進(jìn)行抗性治理，本文通過(guò)東亞飛蝗田間種群對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥的敏感性分析，探討了東亞飛蝗對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥產(chǎn)生抗性的現(xiàn)狀;同時(shí)利用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)，研究分析了抗性產(chǎn)生的生化和分子生物學(xué)機(jī)理，主要研究?jī)?nèi)容如下:
　

2、　一、東亞飛蝗對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥的敏感性分析和增效作用測(cè)定
　　本研究針對(duì)我國(guó)東亞飛蝗發(fā)生規(guī)模、分布特點(diǎn)、農(nóng)藥使用背景差異和種群遺傳特征，采集了河北黃驊、海南黃流和山東無(wú)棣田間種群，選擇有代表性的有機(jī)磷農(nóng)藥進(jìn)行敏感性分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，東亞飛蝗無(wú)棣種群對(duì)馬拉硫磷最為敏感，黃驊種群對(duì)毒死蜱和辛硫磷僅有5.4和2.9倍的抗藥性，而黃驊和黃流兩種群對(duì)馬拉硫磷已產(chǎn)生了57.5和14.8倍的抗藥性?？梢钥闯?，由于東亞飛蝗不同種群馬拉硫磷選擇壓力的差異

3、已經(jīng)造成不同田間種群對(duì)其抗性程度產(chǎn)生了變化，而且不同的有機(jī)磷農(nóng)藥對(duì)同一種群的選擇壓力已產(chǎn)生不同的抗藥性水平。由此說(shuō)明，研究東亞飛蝗對(duì)常用殺蟲(chóng)劑抗性發(fā)生現(xiàn)狀，建立有效的抗性治理策略，是十分必要的。
　　通過(guò)增效劑磷酸三苯酯(TPP)、順丁烯二酸二乙酯(DEM)及氧化胡椒基丁醚(PBO)在河北黃驊田間種群和敏感品系中對(duì)馬拉硫磷的增效試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，無(wú)論在黃驊種群還是敏感品系中，PBO對(duì)馬拉硫磷都沒(méi)有增效作用（增效比分別為0.9和1.1

4、），但在黃驊種群中TPP和DEM對(duì)馬拉硫磷表現(xiàn)出顯著的增效作用（增效比分別為16.2和3.3），而在敏感品系中TPP和DEM沒(méi)有明顯的增效作用(增效比分別為1.4和1.2);由此推測(cè)，酯酶和谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶與黃驊種群馬拉硫磷抗性相關(guān)，而細(xì)胞色素P450與馬拉硫磷抗性無(wú)關(guān)。
　　二、東亞飛蝗有機(jī)磷抗性代謝解毒酶生化機(jī)制研究
　　本研究分析了東亞飛蝗代謝解毒酶系（酯酶、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶和細(xì)胞色素P450氧化酶）的生化特性。東

5、亞飛蝗河北黃驊種群和敏感品系代謝解毒酶活性表現(xiàn)出不同程度的差異，其中黃驊種群酯酶對(duì)α-NA、α-NB及β-NA三種底物的水解活性和谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶對(duì)底物CDNB和DCNB水解活性顯著高于敏感品系，分別是敏感品系的2.1-3.2倍和1.2-2.0倍。而對(duì)于細(xì)胞色素P450活性，兩者之間沒(méi)有顯著差異。酯酶聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果顯示，黃驊種群和敏感品系電泳圖譜中條帶帶型沒(méi)有差異，但黃驊種群條帶染色明顯深于敏感品系。據(jù)此推測(cè)，黃驊種群與敏感品

6、系之間的酯酶活性和谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶差異與河北黃驊東亞飛蝗的抗藥性有關(guān)。
　　用對(duì)氧磷、馬拉氧磷兩種有機(jī)磷抑制劑對(duì)東亞飛蝗海南黃流和山東無(wú)棣種群的羧酸酯酶進(jìn)行體外抑制，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，黃流和無(wú)棣種群的pI50值有顯著差異，黃流種群分別是山東種群的1.16和1.27倍，說(shuō)明黃流種群對(duì)對(duì)氧磷和馬拉氧磷的敏感性較低。然而黃流種群和無(wú)棣種群的羧酸酯酶活性測(cè)定結(jié)果表明，以α-NA和β-NA為底物時(shí)，無(wú)棣種群羧酸酯酶活性分別是黃流種群1.75和

7、1.50倍，具有顯著差異。動(dòng)力學(xué)研究表明，無(wú)棣種群和黃流種群的羧酸酯酶Km和Vmax值沒(méi)有顯著差異。據(jù)分析黃流種群和無(wú)棣種群羧酸酯酶活性的差異可能是由于生態(tài)環(huán)境的不同所導(dǎo)致的種群分化引起的。根據(jù)目前的研究結(jié)果尚難以斷定對(duì)馬拉硫磷生物測(cè)定中LD50值較低的無(wú)棣種群對(duì)其它農(nóng)藥的敏感性如何?；跓o(wú)棣種群較高的羧酸酯酶活性，我們推測(cè)，東亞飛蝗無(wú)棣種群可能對(duì)其它的農(nóng)藥具有較高的抗藥性。
　　三、東亞飛蝗有機(jī)磷抗性靶標(biāo)酶生化機(jī)制研究
　

8、　本研究分析了東亞飛蝗有機(jī)磷靶標(biāo)乙酰膽堿酯酶(acetylcholinesterase，AChE)的生化特性。對(duì)東亞飛蝗黃驊種群、黃流種群、無(wú)棣種群和敏感品系A(chǔ)ChE活性和動(dòng)力學(xué)比較結(jié)果表明，三個(gè)東亞飛蝗田間種群AChE活性與敏感品系相比有顯著差異，黃驊種群、黃流種群和無(wú)棣種群AChE活性分別是敏感品系的4.04、9.55和1.99倍，并且三個(gè)田間種群的Km值與敏感品系相比也有顯著差異;根據(jù)有機(jī)磷殺蟲(chóng)劑對(duì)AChE的體外抑制結(jié)果，河北黃驊

9、種群AChE對(duì)馬拉氧磷、氧化毒死蜱及辛硫磷的敏感性與敏感品系相比分別下降了3.2、2.2和1.1倍。而海南黃流種群對(duì)馬拉氧磷和氧化毒死蜱的敏感性分別下降了11.3和19.2倍。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，對(duì)馬拉硫磷生物測(cè)定中僅有1.8倍抗藥性的山東無(wú)棣種群，其AChE對(duì)馬拉氧磷和氧化毒死蜱的敏感性也分別下降了4.8和2.4倍。
　　結(jié)合東亞飛蝗解毒酶的生化機(jī)制研究，本文認(rèn)為黃驊種群對(duì)馬拉硫磷的抗性機(jī)理主要包括酯酶、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶活性升高和乙酰膽

10、堿酯酶的活性升高以及敏感性下降。黃流種群產(chǎn)生抗性主要是由于AChE的活性升高和敏感性降低引起的。而無(wú)棣種群可能對(duì)其它的農(nóng)藥有較高的抗藥性，導(dǎo)致其AChE敏感性的顯著下降。據(jù)此認(rèn)為，東亞飛蝗不同種群抗性產(chǎn)生機(jī)制是不盡相同的，有可能包括多種不同的抗性機(jī)制。
　　四、東亞飛蝗有機(jī)磷抗性分子機(jī)制研究
　　本研究利用簡(jiǎn)并性引物和降落PCR技術(shù)從東亞飛蝗中克隆獲得了3個(gè)東亞飛蝗羧酸酯酶(carboxylesterases，CarEs)基

11、因的cDNA片段，分別命名為CarE1，CarE2和CarE3。根據(jù)昆蟲(chóng)羧酸酯酶和谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶的保守區(qū)(motif)，采用生物信息學(xué)方法對(duì)東亞飛蝗表達(dá)序列標(biāo)簽(expressingsequencetags，ESTs)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行了全面搜索，并對(duì)其進(jìn)行了羧酸酯酶和谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶ESTs拼接、注釋，獲得了32條羧酸酯酶ESTs和12條谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶ESTs，與克隆獲得的3條羧酸酯酶基因片段同源比對(duì)和拼接后，共得到34條羧酸酯酶基

12、因片段。采用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)對(duì)上述羧酸酯酶和谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶基因在黃驊種群和敏感品系中的表達(dá)量進(jìn)行了比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，羧酸酯酶基因CarE1、CarE4、CarE6、CarE12、CarE15、CarE19、CarE22、CarE23、CarE26、CarE27、CarE30和CarE32在黃驊種群中的表達(dá)量分別是敏感品系的3.29、1.13、8.78、3.16、3.17、11.84、2.24、4.92、6.24、4.66、4.47和

13、4.73倍;谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶基因GST1、GST2、GST3和GST12的表達(dá)量分別是敏感品系的1.25、1.33、2.47和1.61倍。據(jù)此認(rèn)為這些羧酸酯酶基因和谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶基因表達(dá)提高與東亞飛蝗的抗藥性密切相關(guān)。
　　對(duì)東亞飛蝗AChE基因克隆和Westernblot分析結(jié)果認(rèn)為直翅目昆蟲(chóng)AChE基因可能有其特殊性，尚有待進(jìn)一步研究證實(shí)。
　　本文通過(guò)東亞飛蝗不同種群對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥的敏感性分析，揭示了東亞飛蝗的田間

14、抗性現(xiàn)狀。通過(guò)生化和分子生物學(xué)方法分析了東亞飛蝗對(duì)有機(jī)磷的抗性機(jī)理，發(fā)現(xiàn)東亞飛蝗不同種群在產(chǎn)生抗性過(guò)程中的機(jī)制是不盡相同的，有可能包括多種不同的抗性機(jī)制。這些研究結(jié)果對(duì)于有效地進(jìn)行抗性治理，延緩東亞飛蝗的抗性發(fā)展均具有重要的實(shí)踐意義。
　　本文首次借助現(xiàn)有的東亞飛蝗的ESTs數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)抗性相關(guān)解毒酶基因進(jìn)行了系統(tǒng)研究，用real-timePCR對(duì)代謝解毒酶羧酸酯酶基因和谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶基因在抗性和敏感種群中差異表達(dá)進(jìn)行了定量分析，