抗骨肉瘤中藥單體的篩選及蟾毒靈誘導骨肉瘤細胞凋亡相關機理研究.pdf

1、一、研究背景： 骨肉瘤是骨科領域里最常見的惡性骨腫瘤，近二十年來實施的手術聯(lián)合大劑量化療，使骨肉瘤手術后五年生存率提高到60-70﹪。由于化療藥物的劑量大、毒副作用大、費用高，尤其是仍有40-50﹪的骨肉瘤患者對現(xiàn)行的化療方案不敏感以及骨肉瘤的耐藥性已經(jīng)成為進一步提高骨肉瘤患者生存率的瓶頸。目前國際上現(xiàn)行的化療方案已經(jīng)很難在骨肉瘤治療及患者遠期生存率方面有突破性的進展。 傳統(tǒng)中藥源自天然，具有長期的臨床應用基礎，其毒副作

2、用小，治療有效，作用機理有別于化學合成藥物，開發(fā)風險也相對較低，展現(xiàn)出巨大的開發(fā)潛力和產(chǎn)業(yè)發(fā)展前景，己成為新藥開發(fā)和世界醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)的重要發(fā)展方向之一。近年來，中藥對惡性腫瘤的殺瘤、抑瘤作用已引起國內(nèi)外醫(yī)學界廣泛的關注，也是抗癌藥物研發(fā)的一個有效途徑。我們在骨肉瘤的綜合治療程式中，尋找有中國特色的、有效的抗骨肉瘤中藥，研究中藥及其提取物對骨肉瘤的作用可能為骨肉瘤的治療開辟一條新的途徑。 二、研究目的： 1.建立中藥單體對骨肉

3、瘤細胞系作用的中藥篩選研究模型。 2.深入開展新有效中藥對骨肉瘤作用機制的研究，并與傳統(tǒng)化療藥物對照，為臨床應用提供實驗依據(jù)。 3.為開發(fā)和制取新的對骨肉瘤特異作用的中藥創(chuàng)造條件，以進一步開展臨床前期研究。 三、研究內(nèi)容： 1.篩選出具有明顯抑制骨肉瘤細胞增殖的中藥單體選取蟾毒靈，華蟾酥毒基，酯蟾毒配基，高三尖杉酯堿，奇果菌素，冬凌草甲素，槲皮素，表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)，漢黃芩素，黃芩素，野

4、黃芩苷，黃芩苷，柚皮素丁二酸酯，槲皮苷，異槲皮苷和柚皮素，共16種中藥單體，DMSO溶解后，分別取不同濃度梯度，作用骨肉瘤U-20S及U-20S/MTX<'300>(氨甲喋呤耐藥細胞株)，72小時后，MTT法測定它們對骨肉瘤細胞株的半數(shù)有效抑制劑量(IC50)，選用化療藥物氨甲喋呤(MTX)作對照。 2.蟾毒靈等中藥單體誘導骨肉瘤細胞凋亡及對細胞周期的影響實驗設中藥單體處理組和空白對照組，利用下列方法來檢測蟾毒靈等中藥單體誘導骨

5、肉瘤細胞凋亡及對細胞周期的影響：①細胞形態(tài)學及Hoechst 33258細胞核染色，觀察中藥單體誘導骨肉瘤細胞凋亡的細胞形態(tài)學變化；②流式細胞儀技術及Annexin V/PI雙標染色，分析細胞凋亡率及細胞周期；③DNA瓊脂糖凝膠電泳，觀察細胞DNA降解梯形條帶的電泳圖改變。 3.探討蟾毒靈誘導骨肉瘤細胞凋亡作用的分子機制Westem blotting法檢測各組細胞的P53、Bax、Bcl-2和caspase-3凋亡相關蛋白的表達

6、。 4.探討蟾毒靈對骨肉瘤氨甲喋呤敏感及耐藥細胞株的二氫葉酸還原酶(DHFR)表達的影響利用RT-PCR及Westem blotting法，檢測蟾毒靈處理的U-20S及U-20S/MTX<'300>兩株細胞DHFR的mRNA轉(zhuǎn)錄水平和蛋白的改變，探討蟾毒類單體是否對DHFR的表達有影響。 四、研究結果： 1.選取骨肉瘤細胞系，體外培養(yǎng)骨肉瘤細胞為藥物實驗模型，用MTT法及細胞形態(tài)學觀察，在細胞水平檢測了16種中藥

7、單體的體外抗骨肉瘤作用，發(fā)現(xiàn)存在腫瘤抑制作用的(根據(jù)IC50值及細胞形態(tài)學改變)有13種；其中能夠以較低濃度抑制骨肉瘤細胞生長及增殖的中藥單體有10種，對骨肉瘤U-20S及U-20S/MTX<'300>(氨甲喋呤耐藥細胞株)的IC50值分別為： 2.蟾毒靈等中藥單體對骨肉瘤細胞株進行處理后，檢測其誘導骨肉瘤細胞凋亡及對細胞周期的影響，發(fā)現(xiàn)①在形態(tài)學上，部分細胞變圓，變圓細胞呈體積縮小，折光性增強。隨著藥物濃度增大和作用時間的延長

8、，變圓細胞逐漸增多，細胞表面逐漸凸起小膜泡(即凋亡小體)，部分細胞脫壁并見壞死細胞及碎片。而對照組細胞生長活躍，核分裂像多見，細胞異型性明顯。Hoechst 33258染色可見細胞核染色質(zhì)出現(xiàn)濃縮狀態(tài)，凝集成塊的凋亡改變，染色有核裂解、固縮、深染的凋亡細胞出現(xiàn)；②流式細胞儀發(fā)現(xiàn)蟾毒靈對骨肉瘤細胞株具有促進凋亡的作用，且凋亡率隨著濃度的增加而增加，與對照組相比具有明顯的差異性(P<0.01)，提示蟾毒靈誘導細胞凋亡存在一定的濃度依賴性；蟾

9、毒靈處理后的細胞，G0/G1期細胞比例減少，G2/M期細胞比例增加，表明蟾毒靈是通過將細胞阻止在G2/M期來抑制腫瘤細胞的增殖。③DNA瓊脂糖凝膠電泳：10-100ng/ml濃度的蟾毒靈處理48時后，骨肉瘤細胞的DNA電泳出現(xiàn)凋亡的特征性“梯狀”條帶。 3.為了探討蟾毒靈誘導骨肉瘤細胞凋亡作用的分子機制，利用Western blotting檢測凋亡相關蛋白p53，caspase-3，Bax及Bcl-2的表達：蟾毒靈(10-100

10、ng/ml)處理骨肉瘤細胞株48小時后，Bcl-2蛋白的表達隨濃度增加而降低，而p53，Bax的表達隨濃度增加而升高，caspase-3出現(xiàn)明顯活化；Bax/Bcl的比率也隨著藥物隨著濃度的增加而升高。提示蟾毒靈誘導骨肉瘤細胞凋亡是通過影響上述凋亡相關蛋白的表達而作用的。 4.利用RT-PCR及Western blotting法，檢測蟾毒靈處理的細胞DHFR的mRNA轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平的改變，結果發(fā)現(xiàn)蟾毒靈處理后，細胞的DHFR

11、在mRNA轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平均無明顯變化。提示蟾毒靈作用效果不受高表達DHFR影響的同時，也不影響骨肉瘤U-20S及U-20S/MTX<'300>的DHFR的表達。 五、研究結論： 1.通過對16種中藥單體的篩選，能明顯抑制骨肉瘤細胞生長及增殖的中藥單體有：蟾毒靈，高三尖杉酯堿，華蟾酥毒基，酯蟾毒配基，槲皮素，奇果菌素，冬凌草甲素，EGCG，漢黃芩素和黃芩素。 2.蟾毒靈體外能顯著抑制人骨肉瘤細胞U-20S及U-

12、20S/MTX<'300>的生長并能誘導細胞凋亡，誘導腫瘤細胞凋亡可能為蟾毒靈主要的抗腫瘤機理之一。蟾毒靈抑制細胞生長是通過將細胞阻滯在G2/M期，而誘導骨肉瘤細胞凋亡主要與影響凋亡相關蛋白p53，caspase-3，Bax，Bcl-2的表達有關。 3.蟾毒靈對骨肉瘤細胞株的顯著增殖抑制作用不但對骨肉瘤U-20S敏感細胞株有效，對氨甲喋呤耐藥細胞株U-20S/MTX<'300>也同樣有效，其作用效果不受高表達DHFR的影響，提示