miR-196b和miR-30a在慢粒發(fā)病機制中的功能與表達調控研究.pdf

1、慢性粒細胞白血病(ChronicMyelogenousLeukemia，CML)，簡稱慢粒，是一種發(fā)生在造血干細胞的惡性骨髓增殖性疾病，是我國慢性白血病中最常見的一種類型。95％的慢粒具有Ph染色體，即特異性的t(9;22)(q34;q11)核型，并存在BCR-ABL1融合基因的表達。Ph染色體是9號和22號染色體長臂易位的結果，易位使9號染色體長臂(9q34)上的原癌基因ABL和22號染色體(22q11)上的BCR基因重新組合成BCR

2、-ABL1融合基因。不同的BCR-ABL1融合基因類型與疾病表型相關。BCR-ABL1融合基因中，主要由ABL段攜帶細胞惡變的主要信息，ABL1屬Abelson（白血病病毒）家族的非受體酪氨酸激酶，目前主要用于在惡性腫瘤中的研究，而BCR段的斷裂位點主要影響疾病表型。在慢粒中，BCR-ABL1融合基因轉錄為8.5kb的mRNA，并進一步翻譯產生分子質量為210KD的BCR-ABL1融合蛋白P210BCR/ABL，該蛋白具有異常酪氨酸激酶

3、活性，其中ABL的SH1結構域TK活性異常，導致與ATP結合，使與ABL結合的信號轉導蛋白發(fā)生磷酸化而激活，并作用于一系列下游的信號傳導通路，包括RAS-MAPK通路、JAK-STAT通路、PI-3K激酶通路、MYC通路等，不但干擾調節(jié)細胞因子的增殖和抑制凋亡，而且引起造血干細胞調節(jié)生長和分化的必須黏附程序的缺失，最終導致骨髓祖細胞大量增生、凋亡減少與骨髓基質細胞粘附性下降，使大量不成熟的髓細胞釋放到外周血，導致慢粒的發(fā)生。因此，BCR

4、-ABL1融合基因被認為是慢粒發(fā)病的分子病理基礎，也是慢粒診斷、療效觀察、預后等監(jiān)測的有效指標。近年來以BCR-ABL1為靶點的研究主要集中在酪氨酸激酶抑制劑和相關信號轉導通路上，和miRNA相關的研究很少。
　　 miRNA是一類長21～25nt的小分子非編碼單鏈RNA的總稱，由大約70nt大小的可形成發(fā)夾結構的前體加工而來，能夠通過與靶mRNA特異性的堿基互補配對，引起靶mRNA降解或者抑制其翻譯，從而對基因進行轉錄后的表達

5、調控。miRNA在表達上具有組織和時間的特異性，是調節(jié)其他功能基因表達的重要調控分子，參與細胞增殖、凋亡、分化、代謝、發(fā)育、腫瘤轉移等多種生物學過程。miRNA表達與多種腫瘤相關，大約50％得到注解的miRNA在基因組上定位于與腫瘤相關的脆性位點（fragilesite），這說明miRNA在腫瘤發(fā)生過程中起至關重要的作用。研究表明，microRNAs與腫瘤形成相關，既能發(fā)揮腫瘤抑制基因的作用，也能起到癌基因的作用。一個起腫瘤抑制基因作用

6、的miRNA表達下降或者缺失可能是由于miRNA生物合成的任何步驟發(fā)生缺陷造成的，而這最終將導致不適當?shù)膍iRNA靶基因表達，最后可能導致細胞過度增殖、侵入、凋亡減少、不能正常分化或者去分化，引起腫瘤的形成。具有癌基因功能的miRNA過表達也將導致腫瘤發(fā)生，在這種情形下，由于miRNA基因的擴增，持續(xù)性的啟動子活性，miRNA加工的效率增高，或是miRNA的穩(wěn)定性提高等，導致在異常組織或是不適當發(fā)育階段這些miRNA的表達增加，導致其靶

7、基因（抑癌基因）表達下降，引起腫瘤發(fā)生。
　　 本研究首先采用多個生物信息學預測軟件預測靶基因可能是BCR-ABL1的miRNA，相關預測軟件包括TargetScan、PicTa、miRBase、miRanda、Mirnaviewer、DIANATarBase，預測結果表明靶基因可能是BCR-ABL1的miRNA包括miR-196b和miR-30a;其次對miR-196b和miR-30a用生物信息學軟件預測和慢粒關系密切的靶基因

8、，綜合各個軟件的預測結果，表明miR-196b可能的靶基因包括BCR-ABL1和HOXA9，miR-30a可能的靶基因包括BCR-ABL1，因此本課題擬以miR-196b和miR-30a為研究對象，研究其在慢粒中的功能和表達調控。
　　 首先，以K562細胞總RNA為模板，擴增BCR-ABL1mRNA3'UTR序列和HOXA9mRNA3'UTR序列，與psiCHECKTM-2vector連接，構建重組質粒psiCHECKTM-2

9、-BCR-ABL1-3'UTR、psiCHECKTM-2-HOXA9-3'UTR。其次，以重組質粒psiCHECKTM-2-BCR-ABL1-3'UTR、psiCHECKTM-2-HOXA9-3'UTR為模板，進行亞克隆。采用SOE的方法，擴增BCR-ABL1-3'UTR中miR-196b、miR-30a結合位點種子序列分別突變的序列，擴增HOXA9-3'UTR中miR-196b結合位點的2個種子序列突變的序列，構建重組質粒psiCHE

10、CKTM-2-BCR-ABL1-3'UTR-Mutant-196b、psiCHECKTM-2-BCR-ABL1-3'UTR-Mutant-30a、psiCHECKTM-2-HOXA9-3'UTR-Mutant。其次，采用雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)進行靶基因的確認。設立mimics組、NC組、mutant組和mock組進行實驗，在293T細胞中進行轉染，48h后檢測各組熒光值，結果用SPSS13.0的OneWayANOVA進行分析。統(tǒng)計分

11、析結果表明196bmimics+ABL1和四個對照組間均存在顯著性差異(P＜0.05)，即196bmimics降低了熒光值，而四個對照組間無顯著性差異(P＞0.05)，表明miR-196b的靶基因包括BCR-ABL1;196bmimics+HOXA9和四個對照組間均存在顯著性差異(P＜0.05)，即196bmimics降低了熒光值，而四個對照組間無顯著性差異(P＞0.05)，表明miR-196b的靶基因包括HOXA9;30amimics

12、+ABL1和四個對照組間均存在顯著性差異(P＜0.05)，即30amimics降低了熒光值，而四個對照組間無顯著性差異(P＞0.05)，表明miR-30a的靶基因包括BCR-ABL1。
　　 為了進一步驗證miRNA和靶基因的對應關系，我們對miR-196b和miR-30a進行功能學研究。首先，以人基因組DNA為模板，擴增miR-196b前體pre-miR-196b和miR-30a前體pre-miR-30a，與載體plVTHM連

13、接，構建慢病毒表達載體plVTHM-miR-196b和plVTHM-miR-30a。慢病毒表達載體分別和質粒psPAX2、pMD2.G共轉染293T細胞，包病毒，用病毒液感染K562細胞，構建過表達miR-196b細胞和過表達miR-30a細胞，并研究miRNA過表達細胞的增殖、周期、miRNA的表達，以及BCR-ABL1和HOXA9的表達。其次，對miRNA過表達細胞轉染miRNAinhibitor，降低細胞中miRNA的表達，檢測細

14、胞的增殖、周期和BCR-ABL1和HOXA9的表達，判斷回復情況。最后，對靶基因BCR-ABL1和HOXA9轉染相應的siRNA，檢測細胞的增殖、周期和BCR-ABL1和HOXA9的表達，判斷細胞功能是否和過表達miRNA細胞功能一致。結果表明在K562細胞中過表達miR-196b后，細胞增殖明顯抑制，G2期阻滯，miR-196b表達升高，BCR-ABL1蛋白和HOXA9蛋白表達下降。在過表達miR-196b細胞中抑制miR-196b的

15、表達后，細胞增殖增強(P＜0.05)，周期恢復，BCR-ABL1蛋白和HOXA9蛋白水平均升高。在K562細胞中過表達miR-30a后，細胞增殖明顯抑制，G1期阻滯，miR-30a表達升高，BCR-ABL1蛋白表達下降。在過表達miR-30a細胞中抑制miR-30a的表達后，細胞增殖增強(P＜0.05)，周期恢復，BCR-ABL1蛋白水平明顯升高。在K562細胞中轉染ABL1siRNA后，BCR-ABL1mRNA水平下降，BCR-ABL

16、1蛋白水平下降，細胞增殖抑制(P＜0.05)，G1期阻滯，和miR-30a過表達細胞增殖情況基本一致。在K562細胞中轉染HOXA9siRNA后，HOXA9mRNA水平下降，HOXA9蛋白表達水平下降，細胞增殖抑制(P＜0.05)，G1期阻滯，增殖比過表達miR-196b細胞快一些。細胞過表達研究和抑制表達研究的結果進一步證明:miR-196b的靶基因包括BCR-ABL1和HOXA9，miR-30a的靶基因包括HOXA9，且在慢粒中mi

17、R-196b和miR-30a都起到腫瘤抑制作用。
　　 miRNA的表達常常和表觀遺傳有關，表觀遺傳指DNA序列并不發(fā)生變化而基因表達卻發(fā)生了可遺傳的改變，其主要機制是由細胞內除遺傳信息以外的其他可遺傳物質所誘發(fā)且在細胞發(fā)育和增殖過程中能夠穩(wěn)定傳遞。表觀遺傳現(xiàn)象種類很多，但DNA甲基化和組蛋白修飾等表觀遺傳現(xiàn)象最常見，且與惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關，特別是CpG島甲基化所致抑癌基因轉錄失活和N端結構域轉錄后修飾，使DNA甲基化和組

18、蛋白修飾成為目前表觀遺傳學和表觀基因組學在腫瘤研究領域內重要分支。DNA甲基化主要包括整個基因組去甲基化和部分區(qū)域高度甲基化，其中DNA去甲基化在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用尤為明顯，另外組蛋白修飾也是基因表達調控以及誘發(fā)腫瘤形成的重要表觀遺傳機制之一。許多研究揭示，miRNA受甲基化和組蛋白修飾等表觀遺傳機制調控，表觀遺傳對miRNA分子產生重要的調控且直接參與腫瘤發(fā)生發(fā)展等過程。因此本課題下一步將研究miR-196b和miR-30a在慢粒中

19、的表達是否和表觀遺傳調控有關。
　　 首先，采用去甲基化藥物5-Aza-2’-dc處理K562細胞，檢測K562處理前后細胞的周期、凋亡、miR-196b和miR-30a的表達、BCR-ABL1和HOXA9的表達變化。其次，對miR-196b和miR-30a啟動子CpG島進行預測，并采用BSP法檢測K562細胞在5-Aza-2’-dc處理前后miR-196b啟動子CpG島甲基化水平，根據(jù)BSP結果選出一段甲基化程度比較高、處理前

20、后變化比較大的序列在臨床樣本中進行檢測。最后，提取16例慢?；颊吆?0例正常人總RNA，檢測miR-196b和miR-30a的表達水平，提取45例白血病患者和10例正常人基因組，采用MSP法檢測miR-196b啟動子CpG島甲基化水平，采用SPSS13.0的多樣本率比較x2檢驗對MSP的結果進行統(tǒng)計學分析。K562細胞中的研究結果表明，K562用5-Aza-2’-dc處理后，G2期發(fā)生阻滯，增殖抑制，出現(xiàn)凋亡。K562細胞中miR-19

21、6b啟動子CpH島高甲基化，用甲基化轉移酶抑制劑處理后，甲基化水平下降，BCR-ABL1蛋白和HOXA9蛋白水平均下降，但miR-196b的表達并未恢復，提示降低miR-196b啟動子CpG島甲基化水平，可使miR-196b的靶基因BCR-ABL1和HOXA9表達下降，但該作用是否通過改變miR-196b的表達來實現(xiàn)，需進一步研究。臨床樣本研究表明，慢?；颊咧衜iR-196b的表達低于正常人，統(tǒng)計各類型白血病和正常人中甲基化陽性和甲基化

22、陰性的比例，結果采用多樣本率比較x2檢驗進行分析，結果表明各類型樣本間差異有顯著性意義(P＜0.05)，其中CML中miR-196b啟動子CpG島甲基化和正常人相比有顯著性差異(P＜0.05)，且CML中miR-196b啟動子CpG島甲基化陽性率高于正常人。結合細胞和臨床樣本研究結果，我們得到結論:慢粒中miR-196b低表達，降低miR-196b啟動子CpG島甲基化水平，可導致其靶基因BCR-ABL1和HOXA9表達下降，提示miR-

23、196b啟動子CpG島高甲基化可能和慢粒發(fā)病有關。關于miR-30a臨床樣本的研究表明，慢粒患者中miR-30a的表達低于正常人，細胞功能學研究表明miR-30a在慢粒中是抑癌基因，因此推測miR-30a的低表達和慢粒的發(fā)生機制有關，但是miR-30a啟動子沒有預測到有CpG島，因此推測miR-30a的表達降低和miR-30a啟動子CpG島甲基化水平無關，另有其它機制，如miR-30a啟動子發(fā)生突變，miR-30a存在雜合性缺失等，具體

24、機制有待進一步研究。
　　 綜上所述，本課題在生物信息學預測的基礎上，采用雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)初步確認了miR-196b和miR-30a的靶基因，接著在K562細胞中進行了過表達和抑制表達研究，闡明了慢粒中miR-196b和miR-30a的功能，證明了miR-196b的靶基因包括BCR-ABL1和HOXA9，miR-30a的靶基因包括BCR-ABL1，且在慢粒中miR-196b和miR-30a都起到腫瘤抑制作用。最后采用B

25、SP法檢測了K562細胞在用去甲基化藥物處理前后miR-196b啟動子CpG島甲基化水平，并采用MSP法檢測了45例白血病患者和10例正常人中miR-196b啟動子CpG島甲基化情況，并檢測了miR-196b和miR-30a在慢粒和正常人中的表達，結果提示慢粒中miR-196b啟動子CpG島的高甲基化可能和miR-196b的低表達有關，miR-196b的低表達是引起慢粒發(fā)病的機制之一，也為慢粒的治療提供了一個潛在靶點。結果也表明miR-