miR-34a調控Ankyrin-B表達在房顫發(fā)生中作用的研究.pdf

1、研究背景及目的:房顫(心房纖顫)在臨床上極為普遍,但由于目前對房顫的發(fā)生發(fā)展的機制仍未研究透徹,以致至今對房顫的治療效果不完全理想,且遠期復發(fā)率仍較高。目前對房顫發(fā)生機制的認識主要為電重構,結構重構等過程。microRNAs作為表觀遺傳學的一個組成部分,參與了各種生理、病理生理過程的發(fā)生發(fā)展,得到人們越來越多的重視。近年研究發(fā)現(xiàn)miR-34a在心臟衰老和纖維化中起到重要的作用,而其中的一個預測靶蛋白錨蛋白-B(Ankyrin-B,Ank

2、-B)在獲得性、遺傳性心臟病中的作用也得到了人們關注。目前發(fā)現(xiàn)Ankyrin-B的表達變化在房顫中發(fā)揮著重要作用,但兩者之間是否存在相互作用關系,miR-34a是否對Ank-B進行調控,從而參與了心房重構的發(fā)生,并在房顫的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮一定的作用。本實驗即利用房顫患者和培養(yǎng)細胞模型進行研究,探討microRNAs參與房顫發(fā)生發(fā)展的新機制,為房顫新的治療方法的提出奠定理論基礎。
　　研究方法:
　　1.選取臨床上行瓣膜置換術的

3、風濕性瓣膜病的房顫心律(房顫組)和竇性心律(竇性組)患者的心房組織,利用real time qPCR檢測microRNA的表達,免疫組化和免疫印跡(Western Blotting)檢測Ank-B的表達。
　　2.原代培養(yǎng)SD乳鼠心房肌細胞,并利用鹽酸異丙腎上腺素刺激培養(yǎng)的心肌細胞來模擬房顫早期細胞電生理改變,real time qPCR檢測miR-34a的表達變化,并根據miR-34a的表達情況選擇鹽酸異丙腎上腺素的最佳處理時間

4、。
　　3.利用miR-34a的特異性干擾試劑,Agomir、Antagomir以及分別的陰性對照試劑Ago-N、Ant-N,對miR-34a的表達進行干預,檢測Ank-B、Na+/Ca2+交換體1(NCX1)的蛋白表達變化。
　　4.加入鹽酸異丙腎上腺素后進一步檢驗步驟3中各項指標的變化。
　　5.利用激光共聚焦顯微鏡檢測miR-34a的特異性干擾試劑以及鹽酸異丙腎上腺素作用下,細胞內Ca2+信號的變化。
　　

5、6.利用雙熒光素酶報告基因驗證miR-34a與Ank-B的mRNA3`端非翻譯區(qū)(Untranslated Regions,UTR)靶向結合。
　　研究結果:
　　1.miR-34a在房顫組心房組織中的表達較竇性組增高,而Ank-B的表達較竇性組降低。
　　2.利用原代培養(yǎng)的SD乳鼠心房肌細胞,給予鹽酸異丙腎上腺素刺激,并根據miR-34a的表達情況選擇出最佳鹽酸異丙腎上腺素作用時間為12h。
　　3.成功對mi

6、R-34a進行特異性干擾,與空白組相比,Agomir組Ank-B及NCX1蛋白表達降低,Antagomir組Ank-B及NCX1蛋白表達增高,各自陰性對照組Ank-B與NCX1的表達與空白組無明顯差異。
　　4.進一步加入鹽酸異丙腎上腺素處理后,發(fā)現(xiàn)處理后較處理前,除了Antagomir組以外,其余各組Ank-B的表達較處理前進一步降低,NCX1表達僅在Agomir組較前進一步降低,余較處理前變化不明顯。
　　5.激光共聚焦

7、檢測發(fā)現(xiàn),與空白組相比,鹽酸異丙腎上腺素+Agomir組細胞內Ca2+信號較其他組更強,單獨鹽酸異丙腎上腺組次之,單獨Agomir組隨后,Ca2+信號強度依次減弱。
　　6.雙熒光素酶報告基因顯示,轉染野生型(WT)ANK2載體的細胞中,與空白組相比,Agomir組熒光比值降低,Antagomir組熒光比值略增高,各自陰性對照組熒光比值與空白組無明顯差異;轉染突變型(MUT)ANK2載體的細胞中,各組熒光比值均無明顯差異。