miR-30a大多發(fā)性硬化癥及EAE中的作用和機(jī)制研究.pdf

1、多發(fā)性硬化癥(Multiple Sclerosis，MS)是經(jīng)典的中樞神經(jīng)系統(tǒng)(centralnervous system，CNS)自身免疫性脫髓鞘疾病。由于對(duì)MS的發(fā)病機(jī)制了解有限，并且缺乏敏感的生物學(xué)標(biāo)記物，此病早期有效的診斷和治療十分困難。
　　 目前認(rèn)為，MS的發(fā)病主要是由于T細(xì)胞對(duì)自身的髓鞘蛋白產(chǎn)生了自身免疫反應(yīng)，并導(dǎo)致一系列復(fù)雜的神經(jīng)退行性改變。其中，CD4+T輔助細(xì)胞(T helper cells，Th cells

2、)介導(dǎo)的自身免疫反應(yīng)是MS發(fā)病最關(guān)鍵的因素。Th細(xì)胞在不同的條件下可以分化為不同種類的T細(xì)胞亞群，包括Th1、Th2、Th17以及Treg等。其中，Th17是被發(fā)現(xiàn)的新型Th細(xì)胞亞群，以能夠分泌IL-17為主要特點(diǎn)。目前認(rèn)為Th17細(xì)胞在MS的病理發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用。研究表明，MS患者外周血Th17細(xì)胞比例明顯高于健康對(duì)照。此外，MS患者IL-23受體及RORc（調(diào)節(jié)Th17分化的關(guān)鍵細(xì)胞因子受體和轉(zhuǎn)錄因子）的表達(dá)水平也高于健康對(duì)照

3、。在MS的動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)性變態(tài)反應(yīng)性/自身免疫性腦脊髓炎(Experimental Allergic/AutoimmuneEncephalomyelitis，EAE)中發(fā)現(xiàn)，IL-17中和抗體，可以延緩EAE所致的神經(jīng)功能障礙的發(fā)生;Th17細(xì)胞缺失或Th17細(xì)胞數(shù)目的減少可以使小鼠對(duì)EAE的敏感性下降。因此，調(diào)控Th17細(xì)胞的分化和IL-17的分泌是治療EAE的關(guān)鍵點(diǎn)之一。雖然現(xiàn)有研究從細(xì)胞因子、受體及信號(hào)通路、轉(zhuǎn)錄因子層面對(duì)Th17極

4、化機(jī)制有一定程度的了解，但是，表觀遺傳學(xué)修飾在Th17分化和EAE中的作用，目前還知之甚少。
　　 小RNA(microRNA，miRNA)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)控是表觀遺傳學(xué)修飾的重要機(jī)制之一。microRNAs是在真核生物中發(fā)現(xiàn)的一類內(nèi)源性的非編碼RNA，在許多人類疾病中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)的作用，有可能作為診斷、預(yù)后生物學(xué)標(biāo)記物和疾病的治療靶標(biāo)。我們通過microRNA的靶基因預(yù)測(cè)軟件，挑選出106條可能調(diào)控Th17分化的microR

5、NA，并結(jié)合已有的microRNA在自身免疫性疾病病灶中表達(dá)數(shù)據(jù)分析，我們將重點(diǎn)研究miR-30a在MS發(fā)生中的作用。
　　 我們將探討miR-30a在MS患者和EAE小鼠外周血單個(gè)核細(xì)胞中的表達(dá)模式，miR-30a對(duì)EAE的治療作用以及miR-30a調(diào)控Th17細(xì)胞分化的可能機(jī)制。以期為MS的診斷和治療提供新的分子靶點(diǎn)，也為Th17細(xì)胞分化的表觀遺傳調(diào)控提供新的分子機(jī)制。在本研究中，我們首先采集了復(fù)發(fā)緩解型MS患者復(fù)發(fā)期和緩解

6、期的外周血，分離外周血單個(gè)核細(xì)胞，檢測(cè)了miR-30a的表達(dá);然后分離EAE小鼠的外周血單個(gè)核細(xì)胞，研究了miR-30a表達(dá)與IFN-γ、IL-4、TGF-β和IL-17表達(dá)的相關(guān)性;進(jìn)一步，我們通過給動(dòng)物注射髓鞘相關(guān)糖蛋白片段誘導(dǎo)其 CNS脫髓鞘，建立了穩(wěn)定的MS的動(dòng)物模型，并通過尾靜脈注射miR-30a的慢病毒，檢測(cè)miR-30a對(duì)EAE的治療作用;最后，我們構(gòu)建了SOCS1和IRF4的3'非編碼區(qū)野生型和突變質(zhì)粒，采用熒光素酶雙報(bào)

7、告系統(tǒng)研究了miR-30a與靶基因SOCS1和IRF4的3'UTR區(qū)的結(jié)合。主要研究結(jié)果如下:
　　 1、針對(duì)收集得到的8例MS患者和4例正常健康對(duì)照者的血液，我們采用EDTA抗凝，淋巴細(xì)胞分離液密度梯度離心法得到外周血單個(gè)核細(xì)胞，進(jìn)一步用流式細(xì)胞分選的方法收集得到了CD4+T細(xì)胞，細(xì)胞存活率和純度均大于99％。
　　 2、將采集的到的外周血單個(gè)核細(xì)胞，采用Real-time PCR檢測(cè)miRNA-30a表達(dá)水平的變化。

8、發(fā)現(xiàn)在MS復(fù)發(fā)期和緩解期miR-30a的表達(dá)較對(duì)照組均明顯下調(diào)，具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。緩解期中miR-30a的表達(dá)略高于復(fù)發(fā)期，但無顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 3、我們通過給動(dòng)物注射髓鞘相關(guān)糖蛋白片段MOG35-55誘導(dǎo)EAE，發(fā)現(xiàn)小鼠從免疫第11天開始陸續(xù)發(fā)病，潛伏期為12.95±2.5天，發(fā)病率為93.3％。死亡率為6.67％。發(fā)病后小鼠一般情況較正常組差，表現(xiàn)為精神萎靡，體重減輕或增長緩慢，皮毛不光滑，活動(dòng)量減少，并出現(xiàn)明顯

9、的神經(jīng)系統(tǒng)癥狀。
　　 4、我們分別于免疫后第10、16天，即EAE發(fā)病前期和EAE急性進(jìn)展期，分離小鼠脾臟中CD4+T細(xì)胞，檢測(cè)其miR-30a表達(dá)水平改變。結(jié)果顯示，EAE發(fā)病前期，小鼠脾臟CD4+T細(xì)胞中miR-30a的表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組。EAE小鼠急性進(jìn)展期CD4+T細(xì)胞的比例及CD4+T細(xì)胞內(nèi)miR-30a的表達(dá)水平均明顯低于對(duì)照組。
　　 5、為了研究miR-30a主要通過哪一種CD4+T細(xì)胞發(fā)揮作用，我

10、們采用慢性非緩解性EAE小鼠動(dòng)物模型，在EAE急性炎癥期，分離小鼠脾臟單個(gè)核細(xì)胞，檢測(cè)細(xì)胞因子IFN-γ、IL-4、TGF-β和IL-17a的表達(dá)以及miR-30a的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著miRNA-30a表達(dá)升高，IL-17a的表達(dá)是下降的，兩者之間的表達(dá)水平呈顯著負(fù)相關(guān)。細(xì)胞因子IFN-γ、IL-4和TGF-β的表達(dá)無顯著線性關(guān)系。
　　 6、為了研究miR-30a是否對(duì)小鼠EAE發(fā)病具有調(diào)控作用，我們構(gòu)建并包裝了高滴度的mi

11、R-30a過表達(dá)病毒，尾靜脈注射病毒到EAE小鼠體內(nèi)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-30a過表達(dá)病毒注射組的EAE評(píng)分相對(duì)于對(duì)照組發(fā)病明顯減輕，差異具有顯著性。
　　 7、我們進(jìn)一步檢測(cè)miR-30a過表達(dá)病毒注射對(duì)EAE小鼠脊髓的病理改變的影響，通過Fast Blue和HE染色，分別觀察脊髓的脫髓鞘和炎癥浸潤程度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-30a過表達(dá)病毒注射組小鼠脊髓脫髓鞘和炎細(xì)胞浸潤明顯輕于對(duì)照組，統(tǒng)計(jì)分析顯示，結(jié)果相差顯著。
　　

12、8、我們采用microRNA靶基因預(yù)測(cè)軟件Targetsan和Starbase對(duì)miR-30a的靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-30a的種子序列(ACAAAUG)可以和Th17分化相關(guān)重要轉(zhuǎn)錄因子SOCS1和IRF4的3'非編碼區(qū)堿基序列不完全互補(bǔ)配對(duì)。
　　 9、我們進(jìn)一步將靶基因SOCS1和IRF4的3'非編碼區(qū)克隆到熒光素酶報(bào)告基因上游，并設(shè)計(jì)3'非編碼區(qū)的突變體，克隆到熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒中，與miR-30a共轉(zhuǎn)染293T

13、細(xì)胞，加入熒光素酶底物，檢測(cè)熒光強(qiáng)度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-30a和含SOCS1、IRF43'非編碼區(qū)的熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染組，熒光強(qiáng)度明顯低于miR-30a陰性對(duì)照與含SOCS1、IRF43'非編碼區(qū)的熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染組，統(tǒng)計(jì)分析具有顯著性差異。但是，miR-30a和含SOCS1、IRF43'非編碼區(qū)突變體的熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染組，熒光強(qiáng)度與對(duì)照組沒有顯著差異。
　　 本研究的重要結(jié)論如下:
　　 1、 MS患者

14、外周血單個(gè)核細(xì)胞中miR-30a的表達(dá)水平較健康對(duì)照組明顯下降。EAE發(fā)病潛伏期和急性發(fā)病期，小鼠CD4+T細(xì)胞中miR-30a的表達(dá)水平較健康對(duì)照組均明顯下降。
　　 2、 EAE急性發(fā)病期，miR-30a與炎性細(xì)胞因子IL-17a的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。
　　 3、 EAE小鼠在體給予miR-30a后，可以明顯緩解EAE的發(fā)病，表現(xiàn)為行為學(xué)評(píng)分明顯下降，脫髓鞘程度明顯減輕，炎細(xì)胞浸潤明顯減少。
　　 4、 miR-3