miR-22在主動脈夾層發(fā)病機制中的作用及調(diào)控機制研究.pdf

1、目的:明確miR-22對血管平滑肌細胞作用及其在主動脈夾層發(fā)病中的作用及調(diào)控機制。
　　方法:1.在符合倫理要求前提下，收集正常捐獻者主動脈組織8例，主動脈夾層患者主動脈10例;提取主動脈組織總RNA進行qRT-PCR檢測miR-22表達含量;主動脈組織冰凍包埋切片，通過miRNA熒光原位雜交和細胞免疫熒光共定位檢測miR-22在主動脈組織中分布差異;2.轉(zhuǎn)基因Tg(Flik1:egfp)斑馬魚系胚胎單細胞時期顯微注射MO-22，

2、于注射后斑馬魚20phf、24phf、30phf收集斑馬魚胚胎各20枚提取總RNA，qRT-PCR檢測miR-22表達變化;分別于斑馬魚24phf、30phf在熒光顯微鏡下觀察斑馬魚節(jié)間血管及背動脈生長情況;3.構(gòu)建miR-22上調(diào)和下調(diào)腺病毒，GCP觀察法確定腺病毒轉(zhuǎn)染最佳MOI值，腺病毒轉(zhuǎn)染HASMC48小時后，提取HASMC總RNA，qRT-PCR檢測miR-22表達變化;miR-22上調(diào)和下調(diào)腺病毒轉(zhuǎn)染HASMC，于轉(zhuǎn)染后0h、

3、12h、24h、36h、48h用CCK-8法檢測HASMC增殖變化，轉(zhuǎn)染后36h顯微鏡下拍照計數(shù)，統(tǒng)計HASMC增殖;miR-22上調(diào)和下調(diào)腺病毒轉(zhuǎn)染HASMC48小時后利用annexinⅤ-APC及7-AAD雙染色后流式細胞儀檢測HASMC凋亡;利用生物信息學(xué)軟件預(yù)測miR-22靶基因;分別提取正常捐獻者與主動脈夾層患者主動脈組織總蛋白，miR-22上調(diào)和下調(diào)腺病毒轉(zhuǎn)染HASMC72小時后提取細胞總蛋白，Western blot檢測m

4、iR-22預(yù)測MAPK14表達變化;siRNA沉默MAPK14的表達，MAPK14 siRNA與Anti-miR-22共同轉(zhuǎn)染HASMC，annexinⅤ-APC及7-AAD雙染色后流式細胞儀檢測HASMC凋亡，與對照組比較MAPK14和Anti-miR-22對HASMC凋亡的作用;4.3周齡FVB小鼠普通飲食喂養(yǎng)，飲用水中添加β-氨基丙腈1 g/kg/day，2周后，尾靜脈注射miR-22 Agomir/antagomir15OD/只

5、，持續(xù)喂養(yǎng)至小鼠7周齡時，局麻下小鼠背部皮下植入血管緊張素Ⅱ微泵（1μg/kg/min）24小時，小鼠注射大劑量苯巴比妥麻醉后處死，解剖分離主動脈根部至髂總動脈小鼠主動脈，大體標本觀察統(tǒng)計小鼠主動脈夾層發(fā)生率，主動脈分為3段，10％福爾馬林固定石蠟包埋切片，分別提取RNA、蛋白;通過qRT-PCR檢測miR-22表達含量;Western blot檢測MAPK14表達變化;小鼠主動脈石蠟切片HE染色測量小鼠主動脈中膜厚度(MT)、管腔直徑

6、(LD)，計算MT/LD; EVG染色比較小鼠主動脈彈力纖維變化，Masson染色檢測小鼠主動脈膠原纖維變化。
　　結(jié)果:1.qRT-PCR驗證了miR-22在主動脈夾層患者主動脈組織中含量表達下調(diào)(P＜0.05)，通過熒光原位雜交及主動脈細胞共定位，發(fā)現(xiàn)miR-22在主動脈夾層患者主動脈平滑肌細胞中表達顯著下調(diào);2.通過對轉(zhuǎn)基因Tg(Flik1:egfp)斑馬魚系胚胎單細胞時期顯微注射MO-22，發(fā)現(xiàn)MO-22可使斑馬魚20-3

7、0phf時間內(nèi)miR-22表達下調(diào)(P＜0.05);miR-22下調(diào)可顯著抑制斑馬魚24phf節(jié)間血管的生長，在斑馬魚30phf時MO-22可顯著抑制斑馬魚背動脈的生長;3.Ad-miR-22和Anti-miR-22轉(zhuǎn)染HASMC的最佳MOI值為100; Anti-miR-22轉(zhuǎn)染HASMC36h后可抑制HASMC的增殖，Ad-miR-22在轉(zhuǎn)染HASMC36h時可促進HASMC的增殖;Anti-miR-22較其對照組相比促進HASMC

8、的凋亡，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);生物信息學(xué)預(yù)測MAPK14是miR-22的潛在靶基因，通過提取人主動脈夾層患者主動脈組織和HASMC蛋白進行Western blot證明MAPK14符合miR-22的靶基因生物學(xué)功能，與miR-22在主動脈夾層患者主動脈組織中的表達相反，MAPK14在主動脈夾層患者組織中表達上調(diào)，且在HASMC中，Ad-miR-22可使MAPK14表達下調(diào)，Anti-miR-22則促進MAPK14的表達;通

9、過雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)直接證實MAPK14是miR-22的靶基因;利用siRNA沉默HASMCMAPK14的表達，同時通過腺病毒抑制HASMC中miR-22的表達，發(fā)現(xiàn)HASMC的凋亡受到顯著抑制;4.通過qRT-PCR證明Ago-miR-22可顯著促進小鼠主動脈miR-22的表達，Antago-miR-22較對照組相比抑制小鼠主動脈miR-22的表達(P＜0.05);收集小鼠主動脈提取組織總蛋白，Western blot證明Ago-

10、miR-22組小鼠主動脈MAPK14表達上調(diào)，而Antago-miR-22組小鼠主動脈組織MAPK14表達下調(diào)。通過對小鼠主動脈解剖進行大體標本觀察統(tǒng)計，夾層造模組、agomir-22組、agomir-NC組5/18(27.8％)，antagomir-22組、antagomir-NC組小鼠主動脈夾層發(fā)生率分別為6/18(33.3％)、12/18(66.7％)、11/17(64.7％)、7/18(38.9％)，經(jīng)統(tǒng)計分析，agomir-2

11、2組較其對照組相比可顯著抑制小鼠主動脈夾層的發(fā)生(P＜0.05)，antagomir-22組較其對照組相比主動脈夾層發(fā)生無統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.1267);夾層造模組、agomir-22組、agomir-NC組、antagomir-22組、antagomir-NC組五組的中膜厚度值分別是74.76±4.59μ m、118.94±5.76μ m、81.23±3.05μ m、65.59±3.74μ m、94.76±4.02μ m;主動脈管腔直

12、徑分別是2.54±0.21mm、1.55±0.11mm、3.12±0.2mm、3.74±0.2mm、1.55±0.11mm、2.94±0.14mm;miR-22上調(diào)可使小鼠主動脈MT增大，LD降低，MT/LD增大，而miR-22下調(diào)使小鼠主動脈MT降低，LD增大，MT/LD降低;agomir-22組較對照相比增加小鼠主動脈彈力纖維，antagomir-22組較對照組相比使小鼠主動脈彈力纖維減少，結(jié)構(gòu)紊亂，甚至斷裂; miR-22上調(diào)可增

13、加小鼠主動脈膠原纖維，而miR-22下調(diào)導(dǎo)致小鼠主動脈中外膜膠原纖維降低。
　　結(jié)論:1.miR-22在主動脈夾層患者主動脈平滑肌細胞中表達顯著下調(diào);2.MO-22可顯著抑制斑馬魚24phf節(jié)間血管生長并抑制30phf斑馬魚背動脈生長;3.Anti-miR-22抑制HASMC增殖，Ad-miR-22可促進HASMC增殖，Anti-miR-22通過上調(diào)miR-22靶基因MAPK14的表達促進HASMC凋亡;4.MAPK14在小鼠主動