人急性T-淋巴細胞性白血病小鼠模型建立與鑒定.pdf

1、目的：
　　本實驗利用人急性 T淋巴細胞白血病細胞株 Jurkat在重度聯合免疫缺陷（SCID）小鼠建立急性 T淋巴細胞系白血病動物模型，并從形態(tài)學、免疫學等方面進行模型的鑒定。然后通過對Notch1基因及釵頭轉錄因子3（Foxp3）基因的表達研究，初步探討Notch1/Foxp3與人急性T淋巴細胞白血病的關系。
　　研究內容和方法：
　　第一部分：SCID小鼠急性T淋巴細胞白血病模型的建立
　　1. Jurka

2、t細胞株的培養(yǎng)，瑞氏-吉姆薩、POX、PAS染色觀察細胞形態(tài)，流式細胞儀檢測其免疫表型。
　　2.給予5周齡雌性SCID小鼠對照組（n=10）環(huán)磷酰胺腹腔注射，按100 mg/kg每只，連續(xù)2天，腹腔注射環(huán)磷酰胺后第一天，經尾靜脈注射接種處于對數生長期的Jurkat細胞，每只小鼠按5×106/只，以0.2ml注射容積注射，連續(xù)注射兩天，注射時速度宜緩慢；對照組給予注射相同劑量的生理鹽水。
　　3.觀察各組小鼠移植后行為及狀態(tài)

3、變化。
　　4.定期經尾靜脈采血，行外周血白細胞計數檢查，制作外周血涂片，計數外周血中淋巴細胞百分比。
　　5.骨髓涂片染色行瑞氏-吉姆薩染色、POX染色、PAS染色，進行有核細胞分類。
　　6.流式細胞術檢測小鼠骨髓中抗人CD3+細胞比率。
　　7.病理檢查解剖瀕死小鼠或者在移植后第60天處死小鼠后，迅速切取心臟、肝、脾、肺、腎臟、胸骨、腦以4％多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋切片，蘇木精-伊紅染色，光鏡觀察各組織發(fā)

4、生病理學改變的情況。
　　8.將SCID小鼠器官組織切片準備好，以抗人-CD3抗體進行免疫組化檢測，以DAB及過氧化氫進行染色。
　　第二部分：Notch1/Foxp3與T-ALL關系的初步探討
　　1. Trizol法提取各小鼠的全血的總RNA，并逆轉錄為cDNA，采用RT-PCR法檢測Notch1基因及Foxp3基因的表達情況。
　　2.采用免疫組化檢測腫瘤浸潤組織中Noth1蛋白及Foxp3蛋白表達情況。<

5、br>　　結果：
　　第一部分：
　　1. Jurkat細胞株離心涂片POX（-）、PAS（+），流式細胞儀檢測Jurkat細胞表達CD2、CD3、CD5、CD7。
　　2.對照組小鼠（n=10）隨著時間體重呈漸進增加，模型組小鼠（n=10）移植后在2周后開始呈現逐漸下降的趨勢，體重從發(fā)病前的（13.82±1.63）g下降到（9.75±0.28）g(P<0.05)，并伴有體毛粗糙紊亂，皮膚黏膜蒼白，失明，弓背，步態(tài)不穩(wěn)

6、，活動力明顯減低，呈惡病質，直至死亡。
　　3.對照組小鼠（n=10）均無小鼠死亡，模型組小鼠（n=10）在接種Jurkat細胞后發(fā)病率為80%(8/10)。生存期平均為（54.1±8.04）天，最短為40天，最長為60天，中位生存期為57.3天。
　　4.接種Jukkat細胞后，模型組小鼠（n=10）的白細胞數隨著時間呈漸進性增高，最高為（21.26±3.98）×109/L(P<0.05)，外周血涂片中可見原始淋巴細胞，終

7、末期小鼠外周血中淋巴細胞比率最高為（31.33±6.21）%，而對照組淋巴細胞比率相對穩(wěn)定，波動在（15.20±4.74）%～（21.00±4.07）%。骨髓中有白血病細胞，成群分布。
　　5.對照組小鼠骨髓液中未檢測到人 CD3+淋巴細胞，而在模型組小鼠的骨髓液中檢測到人CD3+淋巴細胞比率為(34.35±4.60)%。
　　6.模型組 SCID小鼠的肝、脾、肺、腎、胃、腸都有腫瘤細胞浸潤，細胞呈團塊狀生長，包繞器官或者浸

8、潤器官內部，受浸潤組織結構破壞，而心肌、腦等組織未發(fā)現明顯腫瘤細胞浸潤。
　　第二部分：
　　1.通過RT-PCR方法檢測，模型組小鼠外周血中有Notch1基因表達，對照組則未檢測到表達。Foxp3基因的相對表達量在對照組為（0.093±0.004），在模型組為（0.4083±0.0115），進行兩個獨立樣本t檢驗，P<0.05，模型組外周血中Foxp3基因表達量明顯高于對照組表達。
　　2.免疫組織化學檢測受累器官組

9、織中Notch1、Foxp3蛋白表達，采用Image-pro plus專業(yè)圖像分析軟件測圖片的平均IOD值，從而對蛋白的表達進行半定量分析，結果示：模型組中Notch1蛋白的表達與Foxp3蛋白的表達與對照組相比，P<0.05，說明模型組中Notch1蛋白、Foxp3蛋白的表達于對照組中的表達的差異具有統(tǒng)計學意義，且均高于對照組的表達。
　　結論：
　　1．采用SCID小鼠在給予環(huán)磷酰胺預處理成功建立了急性T淋巴細胞系白血病