肝癌非手術患者p53熱點突變檢測暨人自噬標簽Atg8家族蛋白變異剪接本的結構分析.pdf

1、第一章肝癌非手術患者p53熱點突變檢測
　　肝癌的發(fā)生發(fā)展過程中會伴隨抑癌基因或原癌基因的突變。含有這些突變的DNA片段會被釋放到血液中，成為循環(huán)無細胞DNA(circulating-cell free DNA，cfDNA)。對cfDNA所攜帶信息進行檢測可以間接獲知非手術肝癌患者體內腫瘤細胞的遺傳變化。抑癌基因p53的突變與多種癌癥的預后相關。肝癌中p53的第249位密碼子AGG→AGT突變（導致p53 R249S突變）是中國和

2、撒哈拉以南非洲肝癌患者p53的高頻突變。本文設計并比較了PCR產物直接測序，高分辨率融解曲線分析(HRM)，特異性封阻PCR(ASB-realtime PCR)三種方法檢測患者血液中是否包含該突變。我們發(fā)現(xiàn)特異性封阻PCR有較好的靈敏度和特異性（靈敏度至少為每個反應10拷貝，突變檢測的特異性底限可達0.1％）。對569例來自于江蘇啟東地區(qū)肝癌患者（421例非手術患者，148例手術患者）進行檢測后，發(fā)現(xiàn)290例含有p53R249S突變(5

3、1.0％)。含有該突變的患者的總體生存時間與R249野生型患者相比，顯著縮短(HR=1.933，95％置信區(qū)間為1.591-2.349，P＜0.0001)。R249野生型p53的患者的中位生存時間為27.0個月(95％CI∶18.6-35.4)，p53 R249S突變的患者為7.0(95％CI∶5.6-8.4)個月，(P＜0.00001)。非手術患者中含有p53 R249S突變的中位生存時間為6.0個月，R249野生型的患者為16.0個

4、月。手術患者中，含有p53 R249S突變的中位生存時間為21.0個月，R249野生型的患者為61.0個月。另外，單位血漿中總p53基因片段多的患者預后較差，但是含有p53 R249S突變基因的患者中，突變片段含量同預后關系不明顯。這些結果證明ASB-realtime PCR是一種檢測cfDNA中突變的好方法，p53 R249S是肝癌預后的一個重要指標。
　　第二章人自噬標簽Atg8家族蛋白變異剪接本的結構分析
　　自噬是真

5、核生物中一種保守的通過溶酶體對細胞內物質進行降解的過程。Atg8和其同源蛋白已經被證實在自噬過程中發(fā)揮重要作用。目前已知的人Atg8家族成員包括6種蛋白，分別為MAP1LC3A，MAP1 LC3B，MAP1LC3C（本文中分另簡寫為LC3A，LC3B，LC3C），GABARAP，GABARAPL1和GABARAPL2。這些蛋白的哪些氨基酸或結構域對于他們同其他蛋白發(fā)生互作，發(fā)揮生理功能是關鍵的，還不是很清楚。分析人Atg8家族蛋白的變異

6、剪接本可以為解決這些問題提供思路。
　　我們選擇LC3B作為重點研究對象，發(fā)現(xiàn)LC3B通過NAGNAG變異剪接可以產生一個缺少Arg68的變異剪接體，我們命名為LC3B-b。這種新型的LC3B分子不能進入正常的翻譯后修飾方式，也不能定位到自噬體上。在之前的同源結構模擬結果提示Arg68的缺失可能會影響LC3B-b分子在溶液中的構象。因此，我們推測Arg68對于維持蛋白質正常生理構象有重要作用。通過溫度梯度的圓二色譜檢測和胰蛋白酶攻

7、擊實驗表明，LC3B-b同正常剪接產生的LC3B-a相比，它對溫度更敏感，暴露的胰蛋白酶酶切位點更多，提示LC3B-b分子內作用力減弱，結構疏松，這與同源結構模擬結果相符。這種構象異常嚴重抑制半胱氨酸蛋白酶Atg4B對LC3B-b分子C末端的剪切，導致LC3B-b的類泛素化修飾和自噬體定位受阻。另一方面，我們將Arg68突變成Ala后，LC3B未被切割的pro型分子顯著增加，自噬體定位減少，細胞自噬水平降低。類似的現(xiàn)象在其他成員中同樣存

8、在。更進一步的結構分析顯示，LC3B的Arg68同Atg4B的Aspl71能形成鹽橋鍵，是兩者互作的關鍵位點。Pull-down實驗證明，突變LC3B的Arg68會減弱兩者相互作用。體外酶切實驗證實突變LC3B的Arg68或者ATG4B的Aspl71均會降低ATG4B的酶切效率。綜上，人Atg8家族蛋白的Arg68對于維持蛋白正常的溶液構象，促進蛋白相互作用有重要意義，是該家族蛋白發(fā)揮正常生理學功能的關鍵氨基酸。
　　為了進一步探

9、討LC3B-b分子是否是可以被機體調控的具有生理學意義的功能分子，我們用熒光定量PCR特異性的檢測了LC3B-a與LC3B-b分子的mRNA表達情況。發(fā)現(xiàn)在人的不同組織和不同的癌細胞系中LC3B-b分子占總LC3B分子的比例存在差異。而且LC3B-b的表達比例在Hep3B細胞受到饑餓刺激或缺氧刺激時會發(fā)生變化。這種變化雖然比較微弱，但提示我們LC3B的NAGNAG變異剪接可能受到機體調控。我們選取了兩個含有與LC3B類似NAGNAG變異