小鼠肥大細(xì)胞蛋白酶4、6的原核表達(dá)和多克隆抗體制備.pdf

1、在肥胖、糖尿病、粥樣動(dòng)脈硬化和腹主動(dòng)脈瘤等代謝疾病發(fā)病機(jī)制中，肥大細(xì)胞起著重要的作用。小鼠肥大細(xì)胞蛋白酶4、6（mMCP4、mMCP6）是小鼠肥大細(xì)胞特異蛋白酶，在肥大細(xì)胞相關(guān)疾病生物學(xué)中具有關(guān)鍵的調(diào)控作用。但是，市場(chǎng)上并沒(méi)有較好的商品化抗體，在一定程度上限制了這些肥大細(xì)胞蛋白酶細(xì)節(jié)作用機(jī)制的研究。因此，原核表達(dá)并制備這些蛋白酶的抗體，將有利于深入探討肥大細(xì)胞的相關(guān)作用機(jī)制。
　　本研究，構(gòu)建了小鼠肥大細(xì)胞蛋白酶4(mMCP4)和

2、6(mMCP6)的原核表達(dá)體系，誘導(dǎo)表達(dá)并純化了包涵體蛋白，并通過(guò)多次皮下注射制備了兔抗mMCP4和兔抗mMCP6多克隆抗體。
　　其具體方法包括：(1)提取小鼠脾細(xì)胞總RNA，運(yùn)用RT-PCR技術(shù)獲得目的基因mMCP4、mMCP6；(2)構(gòu)建重組原核表達(dá)載體pET28a-mMCP4、pET28a-mMCP6，將其轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21中，以異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)融合蛋白表達(dá)；(3)利用Ni親和層析柱純化mMCP4、m

3、MCP6融合蛋白；(4)純化后重組蛋白作為抗原免疫兔子獲得mMCP4多克隆抗體、mMCP6多克隆抗體；(5)采用ELISA法測(cè)抗體效價(jià)，westernblot測(cè)抗體特異性。
　　其具體結(jié)果表明：(1)經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證，所擴(kuò)增目的基因mMCP4、mMCP6序列準(zhǔn)確，所構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a-mMCP4、pET28a-mMCP6成功；(2)經(jīng)SDS-PAGE電泳驗(yàn)證，所誘導(dǎo)并純化的mMCP4、mMCP6融合包涵體蛋白分子量符合預(yù)期，條