砂梨上蘋(píng)果莖痘病毒的分離鑒定及其cp基因遺傳轉(zhuǎn)化煙草研究.pdf

1、梨在世界果品產(chǎn)業(yè)中占有重要的經(jīng)濟(jì)地位。蘋(píng)果莖痘病毒(Apple stem pittingvirus，ASPV)在我國(guó)發(fā)生普遍，該病毒危害可導(dǎo)致梨的產(chǎn)量明顯下降和品質(zhì)降低。對(duì)ASPV的防治措施主要是栽培無(wú)病毒苗木和選育抗病毒品種。近年來(lái)利用基因工程技術(shù)導(dǎo)入病毒外殼蛋白(cp)基因，培育抗病毒新品種的策略，為該病害的防治開(kāi)辟了新的途徑。本研究采用生物學(xué)和分子生物學(xué)方法，對(duì)我國(guó)砂梨(Pyrus pyrifolia)上發(fā)生的ASPV進(jìn)行了分離鑒

2、定；構(gòu)建了ASPV cp基因的植物表達(dá)載體，利用根癌農(nóng)桿菌EHA105介導(dǎo)的葉盤(pán)法進(jìn)行了轉(zhuǎn)化煙草研究，在國(guó)內(nèi)首次得到了轉(zhuǎn)化ASPV cp基因的西方煙(Nicotiana occidental&)植株，為進(jìn)一步利用此策略進(jìn)行抗病毒育種研究奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。取得的主要研究結(jié)果如下： (1)砂梨上ASPV的鑒定和分離。以采集的52份砂梨樣品(采自湖北省農(nóng)科院果樹(shù)桑蠶研究所國(guó)家砂梨種質(zhì)資源圃)為材料，采用試管捕捉反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(T

3、C-RT-PCR)方法對(duì)ASPV進(jìn)行檢測(cè)，其中33份樣品能擴(kuò)增出316 bp的目標(biāo)條帶，樣品帶毒率為63.5％。取其中19份感染ASPV的砂梨樣品和10份本實(shí)驗(yàn)室溫室保存的帶毒砂梨樣品，采用汁液摩擦接種的方法，接種ASPV草本指示植物西方煙。從果茶所采集的19份陽(yáng)性樣品中有9份在西方煙上表現(xiàn)癥狀，實(shí)驗(yàn)室保存的10份帶病毒樣品在指示植物上全部表現(xiàn)出癥狀，且均采用TC-RT-PCR方法進(jìn)行了驗(yàn)證。上述19份感染ASPV的砂梨樣品，在西方煙上

4、的癥狀表現(xiàn)主要有：接種葉片上出現(xiàn)白色壞死斑點(diǎn)；接種葉片上產(chǎn)生黑色斑點(diǎn)，并沿葉脈壞死；接種葉片出現(xiàn)褪綠斑；葉脈黃化等。此外，有少數(shù)帶病毒樣品接種西方煙后不表現(xiàn)明顯癥狀。 (2)ASPV cp基因植物表達(dá)載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化煙草研究。對(duì)來(lái)源于ASPV分離物6-1-13的cp基因進(jìn)行克隆與序列測(cè)定，將完整的ASPV cp基因克隆到植物表達(dá)載體pCAMBIA1301，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10B感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)過(guò)PCR和雙酶切篩選陽(yáng)性克隆，成功構(gòu)建

5、了ASPV cp基因植物表達(dá)載體。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)細(xì)胞，運(yùn)用葉盤(pán)法轉(zhuǎn)化5-6葉期的健康西方煙葉片。通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)化煙草的遺傳轉(zhuǎn)化體系的優(yōu)化，篩選出了適宜的潮霉素濃度、根癌農(nóng)桿菌菌液濃度及合適的浸染時(shí)間。提取分化西方煙植株的總DNA，利用ASPV cp基因的特異引物進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果表明有88株西方煙植株能成功擴(kuò)增出目標(biāo)片段，其中轉(zhuǎn)ASPV cp基因正義鏈的煙草植株68株，轉(zhuǎn)cp基因反義鏈的煙草植株20株，表明ASP