砂梨上蘋果莖痘病毒快速檢測技術(shù)及其外殼蛋白基因克隆和原核表達(dá)研究.pdf

1、梨是我國的傳統(tǒng)果品之一，栽培面3積和總產(chǎn)量都居世界第一，但其單產(chǎn)和品質(zhì)都遠(yuǎn)低于世界先進(jìn)國家的水平，嚴(yán)重影響了我國梨的出口和創(chuàng)匯。病毒病害是影響其產(chǎn)量和品質(zhì)的重要因素，對梨造成了嚴(yán)重的危害。蘋果莖痘病毒(Applestempittingvirus，ASPV)對梨的危害就是典型的實(shí)例。ASPV是凹陷病毒屬(Foveavirus)的代表種，一種潛隱病毒，主要侵染蘋果和梨，只在敏感型的砧木上表現(xiàn)癥狀，常見癥狀為死頂、內(nèi)莖皮壞死、嫁接時(shí)衰退、葉偏

2、上性生長等，能導(dǎo)致梨產(chǎn)量明顯下降和品質(zhì)改變，嚴(yán)重影響著梨業(yè)的發(fā)展。 目前，栽培無病毒苗木是解決梨上ASPV危害的有效途徑，病毒檢測是培育和繁殖無病毒苗木的重要環(huán)節(jié)。另一方面ASPV在蘋果和梨樹中的含量極低，且蘋果和梨樹組織中含有大量酚類等物質(zhì)，病毒的分離提純非常困難，國內(nèi)還沒有能制備用于檢測ASPV的抗體。 本研究采用生物學(xué)、血清學(xué)和分子生物學(xué)三種方法對砂梨上的ASPV進(jìn)行了快速檢測方法的研究，并成功地克隆了來源于砂梨樣

3、品6-1-13上ASPV的外殼蛋白(Coatprotein，CP)基因，對其進(jìn)行了序列測定、原核表達(dá)和western-blot分析，具體研究結(jié)果如下： 生物學(xué)檢測：在溫室，將常規(guī)PAS-ELISA粗檢呈陽性的10個(gè)砂梨樣品通過汁液摩擦接種草本指示植物西方煙(Nicotianaoccidentalis‘37B’)，10個(gè)樣品在西方煙上都產(chǎn)生不規(guī)則小斑點(diǎn)，同時(shí)6-1-13、6-1-103和4-2-51三個(gè)樣品產(chǎn)生脈黃癥狀；通過二重芽

4、接法嫁接木本指示植物，10個(gè)樣品在雜種榅桲(Pyroniaveitchii)上普遍產(chǎn)生葉片反卷、植株矮化、剝開樹皮有痘斑的癥狀，在A20上的癥狀為葉片上有褪綠葉斑，支脈變黃。結(jié)果表明，ASPV采用草本指示植物和木本指示植物檢測，癥狀明顯，結(jié)果可靠。 血清學(xué)檢測：采用常規(guī)的PAS-ELISA、改進(jìn)的PAS-ELISA和直接包被抗原ELISA(PTA-ELISA)，檢測生物學(xué)顯癥的樣品，通過將第二抗與酶標(biāo)A蛋白預(yù)反應(yīng)后混合加入，可降

5、低非特異反應(yīng)，提高陽性樣品和陰性樣品的吸光度比值(P/N)；常規(guī)PAS-ELISA與PTA-ELISA檢測的結(jié)果一致。對樣品6-1-13，采用提取緩沖液等倍稀釋研磨，結(jié)果表明稀釋倍數(shù)越低，P/N值越高，檢測效果越好，一般5倍左右稀釋P/N值較高，結(jié)果較穩(wěn)定。該方法安全可靠、快速準(zhǔn)確，適合大量樣品的檢測。 分子生物學(xué)檢測：參照已報(bào)道的ASPV全基因組核苷酸序列設(shè)計(jì)合成引物，以芽接顯癥的雜種榅桲葉片為材料，提取dsRNA為模板，分別

6、對6-1-13、4-2-51、4-1-51、6-1-35、6-1-73和6-1-103進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，然后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，發(fā)現(xiàn)6個(gè)樣品都在316bp左右的位置上有特異性擴(kuò)增條帶。另外，采用TC-RT-PCR檢測在西方煙上顯癥的樣品6-1-13、4-2-51、6-1-103、6-1-73、6-1-35，6-1-13、4-2-51、6-1-103獲得了預(yù)期的316bp的目標(biāo)片斷，6-1-73、6-1-35沒有獲得目標(biāo)擴(kuò)增片段。以d

7、sRNA為模板的RT-PCR，dsRNA穩(wěn)定不易降解，能更有效地檢測病毒；TC-RT-PCR以管壁的非特異性吸附捕捉病毒粒子，不用提取核酸，操作簡單，同時(shí)也減少了苯酚和氯仿對環(huán)境的污染和人體的傷害。這兩種檢測方法特異性強(qiáng)、敏感性高，檢測結(jié)果穩(wěn)定、可靠，尤其適合大量樣品檢測。 ASPVCP基因克隆和序列測定：參照已報(bào)道的ASPV全基因組核苷酸序列設(shè)計(jì)合成引物，以來源于6-1-13的ASPV的dsRNA為模板，采用RT-PCR擴(kuò)增其

8、CP基因，獲得特異性擴(kuò)增條帶1328bp，并對擴(kuò)增產(chǎn)物純化、T克隆、序列測定和分析。分析表明其核苷酸序列與國外在GenBank上登錄的10個(gè)分離株有較高的同源性，同源率為82％-88％。其中與分離株ST132同源率最高達(dá)88％，與分離株GNKVⅡ/34和N1同源性最低為82％。氨基酸序列與10個(gè)分離株也有很高的同源性，同源率為93％-98％，與分離株GNKVⅡ/34的同源率最低為93％，其他均達(dá)到96％以上。與上述分離株作序列系統(tǒng)進(jìn)化樹

9、分析，發(fā)現(xiàn)同分離株GNKⅢ/45親緣關(guān)系最近。ASPVCP基因原核表達(dá)和western-blot分析：T克隆獲得的目的基因與表達(dá)載體pET28c連接得到原核表達(dá)質(zhì)粒pET28c-CP，pET28c-CP在大腸桿菌BL21(DE3)中表達(dá)，大小44kDa，表達(dá)蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳和western-blot分析表明該病毒的CP在大腸桿菌BL21(DE3)中正確表達(dá)，且具有免疫原性。 以上結(jié)果首次建立了我國砂梨上ASPV的快速檢