小反芻獸疫病毒H基因重組山羊痘病毒的構(gòu)建和鑒定.pdf

1、小反芻獸疫(Peste des Petits Ruminants，PPR)是由小反芻獸疫病毒(Peste desPetits Ruminants virus，PPRV)引起的小反芻動(dòng)物(特別是山羊和綿羊)的烈性、接觸性傳染病。具有極高的發(fā)病率和死亡率。目前，世界各國(guó)都在廣泛使用小反芻獸疫弱毒疫苗來(lái)預(yù)防該病，但無(wú)法從血清學(xué)上區(qū)分PPR疫苗株和野毒株感染，這就給接種過(guò)PPR疫苗的疫區(qū)在血清學(xué)調(diào)查上帶來(lái)困難，影響了該病流行病學(xué)和相關(guān)研究的進(jìn)行

2、。為了解決傳統(tǒng)弱毒疫苗的缺點(diǎn)，本研究構(gòu)建山羊痘病毒通用載體并在此基礎(chǔ)上構(gòu)建了PPRV H基因重組山羊痘病毒，為重組山羊痘病毒和小反芻獸疫基因工程新型疫苗的研制打下初步基礎(chǔ)。 1.啟動(dòng)子P11和P7.5的有效性驗(yàn)證 參照山羊痘病毒(Goatpox virus，GPV)基因序列，設(shè)計(jì)了包含GPV疫苗株復(fù)制非必需區(qū)TK(Thymidine kinase)基因和背靠背啟動(dòng)子P11和P7.5的質(zhì)粒PtkPP，在TK基因中間切開(kāi)，鏈

3、接上背靠背啟動(dòng)子P11和P7.5，兩個(gè)啟動(dòng)子下游設(shè)計(jì)為多克隆位點(diǎn)。為了驗(yàn)證兩個(gè)啟動(dòng)子的有效性，分別在兩個(gè)啟動(dòng)子下游插入EGFP(增強(qiáng)綠色熒光蛋白)基因，構(gòu)建了質(zhì)粒PtkPegfpP和PtkPPegfp，這兩個(gè)重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染羊睪丸(Lamb testicle，LT)細(xì)胞，通過(guò)熒光顯微鏡可以觀察到EGFP的表達(dá)，驗(yàn)證了啟動(dòng)子P11和P7.5能成功表達(dá)EGFP基因后，為后續(xù)工作打下基礎(chǔ)。 2.表達(dá)gpt和EGFP基因重組山羊痘病毒的

4、構(gòu)建和鑒定 在PtkPP啟動(dòng)子P11的下游插入gpt(黃嘌呤鳥(niǎo)嘌呤磷酸轉(zhuǎn)移酶)基因和EGFP基因，構(gòu)建重組質(zhì)粒PtkPgpt-egfpP，EGFP基因位于gpt基因的下游。該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染感染GPV的LT細(xì)胞，同源重組獲得重組病毒rGPV-PtkPgpt-egfpP，利用MPA(霉芬酸)阻斷核酸代謝途徑篩選到穩(wěn)定表達(dá)EGFP基因的重組GPV。為進(jìn)一步開(kāi)展GPV活載體疫苗的研究提供了技術(shù)平臺(tái)。 3.小反芻獸疫病毒H基因重組山

5、羊痘病毒的構(gòu)建和鑒定 依據(jù)GenBank上登陸的小反芻獸疫病毒全基因序列，設(shè)計(jì)合成了小反芻獸疫病毒H基因的引物，用PPRV的cDNA產(chǎn)物為模板，通過(guò)PCR克隆了PPRV H基因。把PPRV H基因克隆到已構(gòu)建好的GPV通用載體PtkPgpt-egfpP啟動(dòng)子P7.5的下游，構(gòu)建了重組質(zhì)粒PtkPgpt-egfpPpprv-H，并通過(guò)酶切鑒定重組質(zhì)粒，大量制備重組質(zhì)粒PtkPgpt-egfpPpprv-H。質(zhì)粒PtkPgpt-eg