醛糖還原酶通過自噬調(diào)控巨噬細(xì)胞固有免疫反應(yīng).pdf

1、【研究背景】
　　醛糖還原酶(Aldose reductase,AR)是糖代謝中多元醇通路的限速酶,負(fù)責(zé)將葡萄糖轉(zhuǎn)化成山梨醇。但是最近的研究發(fā)現(xiàn),AR的作用并不僅僅局限于糖代謝過程,它還被視為介導(dǎo)多種炎癥性疾病的靶分子。許多實(shí)驗(yàn)證實(shí),AR抑制劑(AR inhib itor,ARI)可以有效地抑制炎癥反應(yīng),而過表達(dá)AR會(huì)增強(qiáng)固有免疫反應(yīng)。據(jù)報(bào)道,AR可能通過NF-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)信號(hào)通路調(diào)控炎癥

2、反應(yīng),但是機(jī)制尚不明確。
　　經(jīng)典NF-κB信號(hào)通路在固有免疫反應(yīng)中發(fā)揮非常關(guān)鍵的作用,通過調(diào)控促炎細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄,募集并活化炎癥細(xì)胞來執(zhí)行炎癥反應(yīng)。經(jīng)典N F-κB信號(hào)途徑依賴IK Kβ,IK Kβ存在于一個(gè)與IK Kα和IK Kγ密切相關(guān)的復(fù)合體中。炎癥刺激活化IK Kβ,后者使IκBα泛素化降解,最終激活NF-κB信號(hào)通路,啟動(dòng)炎癥相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄。
　　自噬(Autophagy)是指胞漿內(nèi)的雙層膜包裹部分胞質(zhì)和細(xì)胞內(nèi)需降解

3、的蛋白質(zhì)、細(xì)胞器和病原體等成分形成自噬體(Autophagosome),并與溶酶體融合形成自噬溶酶體(Autolysosome),降解其所包裹的內(nèi)容物,以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞本身的代謝需要和某些細(xì)胞器的更新及清除入侵的病原體。微管相關(guān)蛋白輕鏈3(MAP-LC3),包括I型和II型,II型由其前體I型切掉羧基端30個(gè)氨基酸后與磷脂酰乙醇胺(PE)連接而形成。LC3 II參與自噬泡膜的成熟過程并分布于膜的兩側(cè),因此,通常把它作為成熟自噬泡的標(biāo)記物。選擇

4、性自噬是指游離膜結(jié)構(gòu)識(shí)別并包裹胞質(zhì)內(nèi)的特定底物形成自噬體,并將其降解,比如蛋白聚合物自噬。自噬對(duì)蛋白聚合物的降解需要泛素及p62/SQSTM1(Sequestosome1)的參與。p62作為自噬受體,含有泛素相關(guān)結(jié)構(gòu)域（Ubiquitin-associated domain,UBA),識(shí)別并結(jié)合 K63-聚泛素化的底物(K63-polyubiquitinated substrates),然后進(jìn)一步與泛素樣蛋白(Ubiquitin-lik

5、e protein) LC3結(jié)合,從而使底物進(jìn)入自噬降解途徑。
　　近年來,許多研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞自噬與固有免疫反應(yīng)有著廣泛的相互調(diào)控作用。一方面,固有免疫信號(hào)可以誘導(dǎo)或抑制自噬,自噬是固有免疫的重要組成成分,在抗胞內(nèi)病原體感染中發(fā)揮效應(yīng)器(Effector)作用,最終通過溶酶體降解被自噬體包裹的病原體。另一方面,自噬也參與眾多固有免疫信號(hào)的調(diào)控,然而具體的機(jī)制依然不清。
　　我們前期研究發(fā)現(xiàn):AR參與脊髓損傷后巨噬/小膠質(zhì)細(xì)胞的

6、極化過程;同時(shí)我們體外預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),LPS誘導(dǎo)的AR缺陷(AR knock-out或者knock-down)巨噬細(xì)胞的iNOS表達(dá)量較AR正常組低,而自噬水平(LC3 II/LC3 I)較AR正常組高。那么AR,自噬和固有免疫反應(yīng)這三者之間有著怎樣的聯(lián)系呢?
　　【目的】
　　研究AR,自噬和固有免疫反應(yīng)之間的相互關(guān)系,闡明AR對(duì)固有免疫反應(yīng)的調(diào)控機(jī)制。
　　【方法】
　　1)培養(yǎng)細(xì)胞:野生型(Wide type,

7、WT)和AR敲除型(AR knock-out,AR KO) C57BL/6J小鼠骨髓來源的巨噬細(xì)胞(BMDMs)和來源于小鼠巨噬細(xì)胞瘤的RAW264.7細(xì)胞系。
　　2)設(shè)計(jì)AR siRNA,轉(zhuǎn)染到RAW264.7細(xì)胞,并評(píng)價(jià)效果。
　　3)體外模擬炎癥反應(yīng),提總蛋白,western blot檢測(cè)各組經(jīng)典NF-κB信號(hào)通路上下游的關(guān)鍵分子TLR4,IKKβ,IKKγ,IκBα,p62和iNOS,發(fā)現(xiàn)LPS誘導(dǎo)的AR缺陷(AR

8、 knockout或者knockdown)組IKKβ和IKKγ蛋白水平較AR正常組低。
　　4)提總mRNA,qPC R檢測(cè)各組IKKβ和IKKγ mRNA水平,發(fā)現(xiàn)LPS誘導(dǎo)的AR缺陷組IKKβ和IKKγmRNA水平和對(duì)照組并沒有差異,說明LPS誘導(dǎo)的AR缺陷巨噬細(xì)胞的IK Kβ和IK Kγ蛋白降低發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后水平。
　　5)爬片,免疫組化觀察各組LC3(自噬體Marker)和LAMP1(溶酶體Marker)標(biāo)記的巨噬細(xì)胞

9、,了解AR缺陷對(duì)自噬體形成和成熟的影響;提總蛋白,western blot檢測(cè)各組LC3和LAMP1蛋白水平;收集細(xì)胞,制超薄切片,透射電鏡觀察各組自噬體和自噬溶酶體。
　　6)爬片,免疫組化觀察各組IKKβ、IKKγ分別與LC3和LAMP1的共標(biāo)情況。
　　7)爬片,免疫組化觀察各組IKKβ、IKKγ分別與泛素(Ub)和p62的共標(biāo)情況。
　　8)用3-MA阻斷自噬,提總蛋白,western blot檢測(cè)各組LC3,

10、IKKβ,IKKγ和iNOS的變化。
　　【結(jié)論】
　　1)AR缺陷對(duì)固有免疫反應(yīng)的抑制是由于經(jīng)典NF-κB信號(hào)通路中的IKK復(fù)合體(IKKβ和IK Kγ)在轉(zhuǎn)錄后水平被降解;
　　2)AR缺陷可以誘發(fā)自噬體形成,LPS刺激會(huì)進(jìn)一步促進(jìn)自噬體形成和自噬體成熟;
　　3)LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞的IKKβ和IKKγ廣泛地與自噬體和溶酶體結(jié)合;
　　4)LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞的IKKβ和IKKγ廣泛地泛素化并被p62