幽門(mén)螺桿菌外膜蛋白Omp26重組恥垢分枝桿菌活載體疫苗的研究.pdf_第1頁(yè)
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文檔簡(jiǎn)介

1、幽門(mén)螺桿菌(Helicobacter pylori,Hp)為定植于人胃黏膜的一種微需氧、螺旋狀的革蘭陰性桿菌,已被公認(rèn)為是慢性胃炎、胃十二指腸潰瘍的重要病因,并與胃癌、胃黏膜相關(guān)性淋巴樣組織(MALT)淋巴瘤的發(fā)生密切相關(guān),1994年被世界衛(wèi)生組織定為Ⅰ類(lèi)致癌原(gradeⅠ carcinogen)。由于Hp的感染率極高,預(yù)防和治療Hp感染成為消化領(lǐng)域和醫(yī)學(xué)微生物界的研究熱點(diǎn)。目前常用的治療方案是抗生素加質(zhì)子泵抑制劑或/及鉍劑的“三聯(lián)”

2、、“四聯(lián)”療法,但藥物治療存在一定的不良反應(yīng),停藥后易復(fù)發(fā),治療費(fèi)用較高,患者依從性差及耐藥菌株的不斷增加等問(wèn)題使其發(fā)展受到限制,而疫苗將是預(yù)防和治療Hp感染最經(jīng)濟(jì)有效的方法。Hp蛋白疫苗的免疫原性較低,只有與各種強(qiáng)效的免疫佐劑一起接種時(shí)才具有保護(hù)作用,但這些佐劑存在較大的毒副作用而限制了其進(jìn)一步發(fā)展,而重組活載體疫苗可有效解決這一難題。Hp活載體疫苗為預(yù)防和治療Hp感染提供了一種新的策略。本研究主要分為四個(gè)部分: 第一部分:

3、幽門(mén)螺桿菌Omp26重組恥垢分枝桿菌活載體疫苗株的構(gòu)建。 目的:采用基因工程技術(shù)構(gòu)建幽門(mén)螺桿菌外膜蛋白Omp26大腸桿菌-分枝桿菌穿梭表達(dá)載體,并在恥垢分枝桿菌中進(jìn)行表達(dá),篩選穩(wěn)定表達(dá)幽門(mén)螺桿菌Omp26的重組恥垢分枝桿菌活載體疫苗株,為進(jìn)一步探討其防治Hp感染奠定基礎(chǔ)。 方法:利用PCR技術(shù),以pET32a-Omp26為模板擴(kuò)增Omp26基因片段,PCR產(chǎn)物膠回收后與載體pMD18-T連接,通過(guò)PCR、限制性酶切分析和

4、測(cè)序鑒定陽(yáng)性重組載體,然后將測(cè)序正確的重組載體經(jīng)kpnⅠ和NotⅠ雙酶切后亞克隆至大腸桿菌-分枝桿菌穿梭表達(dá)載體pLA71、pLA73、pJMas和pJHsp70中,構(gòu)建分泌型和非分泌型大腸桿菌-分枝桿菌穿梭表達(dá)載體,利用電穿孔方法將其轉(zhuǎn)入M.s中,構(gòu)建重組恥垢分枝桿菌活載體疫苗株(rM.s),通過(guò)PCR、限制性酶切分析鑒定所構(gòu)建的rM.s疫苗株的正確性,SDS-PAGE及Western blot對(duì)其表達(dá)的蛋白進(jìn)行分析。 結(jié)果:

5、采用PCR方法從pET32a-Omp26中擴(kuò)增出約594bp的DNA片段,目的片段與pMD18-T載體連接后測(cè)序結(jié)果示插入的基因片段為Hp Omp26編碼基因,由594bp組成,與GenBank中菌株HP AY033499序列同源性達(dá)98.8%。將測(cè)序正確的重組T載體分別亞克隆入質(zhì)粒pLA71,pLA73,pJMas,pJHsp70中,構(gòu)建分泌性和非分泌性穿梭表達(dá)載體,PCR和酶切鑒定穿梭表達(dá)載體構(gòu)建成功。將表達(dá)載體利用電穿孔的方法導(dǎo)入

6、M.s中,經(jīng)卡那霉素抗性篩選、限制性酶切分析和PCR鑒定rM.s株構(gòu)建成功。重組質(zhì)粒pPL71-Omp26,pPL73-Omp26在M.s中表達(dá)的蛋白可分泌到細(xì)菌培養(yǎng)上清中,Western blotting在細(xì)胞培養(yǎng)上清中能檢測(cè)到Omp26。重組質(zhì)粒pJMas-Omp26和pJHsp70-Omp26由于缺乏信號(hào)肽,所表達(dá)的蛋白僅存在于細(xì)菌沉淀中。 結(jié)論:成功構(gòu)建了重組大腸桿菌-分枝桿菌穿梭表達(dá)質(zhì)粒pPL71-Omp26,pPL7

7、3-Omp26,pJMas-Omp26和pJHsp70-Omp26;成功構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)幽門(mén)螺桿菌Omp26的重組恥垢分枝桿菌活載體疫苗株。 第二部分:幽門(mén)螺桿菌Omp26重組恥垢分枝桿菌活載體疫苗株體內(nèi)外穩(wěn)定性及安全性研究 目的:研究幽門(mén)螺桿菌Omp26恥垢分枝桿菌活載體疫苗株在小鼠體內(nèi)外的穩(wěn)定性及在小鼠體內(nèi)的定植,并對(duì)疫苗的安全性進(jìn)行評(píng)價(jià)。 方法:將綠色熒光蛋白質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化入構(gòu)建好的重組恥垢分枝桿菌活載體疫苗中,

8、經(jīng)體外傳代培養(yǎng),隨機(jī)挑取20個(gè)菌落觀察熒光表達(dá)及提取質(zhì)粒判斷重組質(zhì)粒的穩(wěn)定性;灌胃免疫BALB/c小鼠,免疫4周和8周后處死小鼠,對(duì)小鼠各內(nèi)臟器官行組織學(xué)檢查,并對(duì)各組織內(nèi)細(xì)菌進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)及質(zhì)粒提取,以判斷重組恥垢分枝桿菌活載體疫苗體內(nèi)的穩(wěn)定性及安全性。 結(jié)果:體外穩(wěn)定性研究結(jié)果表明重組恥垢分枝桿菌活載體疫苗在體外具有高度穩(wěn)定性,在有卡那霉素抗性存在和無(wú)選擇性壓力情況下均可連續(xù)傳代20次而不發(fā)生質(zhì)粒丟失。應(yīng)用rM.s灌胃免疫BA

9、LB/c小鼠后無(wú)明顯的毒副作用出現(xiàn),重組活載體疫苗可穩(wěn)定地存在于胃、脾臟、肺和肝臟。 結(jié)論:綠色熒光蛋白為觀測(cè)rM.s在體內(nèi)的定植提供了更為直觀的手段。rM.s在體內(nèi)外具有高度的穩(wěn)定性,無(wú)明顯毒副作用。 第三部分:重組恥垢分枝桿菌活載體疫苗預(yù)防幽門(mén)螺桿菌感染的研究。 目的:通過(guò)動(dòng)物模型評(píng)價(jià)重組恥垢分枝桿菌活載體疫苗預(yù)防幽門(mén)螺桿菌感染的效果,明確其預(yù)防幽門(mén)螺桿菌感染的作用機(jī)制。 方法:選擇標(biāo)準(zhǔn)化實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SP

10、F級(jí)BALB/c小鼠構(gòu)建Hp定植模型,將2×107 CFUs重組M.s疫苗(pPL73-Omp26)灌胃免疫BALB/c小鼠,同時(shí)設(shè)PBS對(duì)照組、M.s空菌組,免疫4w后,各組處死一批小鼠,取血清、胃、脾組織待用;余下的小鼠用Hp SS1攻擊2次,4w后處死小鼠,行快速尿素酶試驗(yàn),Hp定量培養(yǎng),組織病理學(xué)檢查以評(píng)價(jià)疫苗預(yù)防胃黏膜Hp感染的免疫保護(hù)作用。MTT檢測(cè)脾淋巴細(xì)胞增殖;RT-PCR檢測(cè)小鼠胃粘膜和脾組織中Th1細(xì)胞因子(IFN-

11、γ、IL-2、IL-12)與Th2細(xì)胞因子(IL-4、IL-6、IL-10)的表達(dá);ELISA檢測(cè)血清Hp特異性IgG,IgA,IgG1和IgG2a抗體水平。 結(jié)果:rM.s(pPL73-Omp26)疫苗組胃黏膜中Hp數(shù)量明顯低于PBS對(duì)照組和空菌組,rM.s(pPL73-Omp26)疫苗組不僅可以降低Hp的定植,而且能減輕Hp造成的小鼠胃黏膜的局部慢性炎癥反應(yīng)。用ConA和Hp抗原刺激后rM.s疫苗組小鼠脾淋巴細(xì)胞明顯增殖。免

12、疫后BALB/c小鼠特異性抗體顯示rM.s(pPL73-Omp26)疫苗組誘導(dǎo)血清Hp特異性抗體IgG、IgA、IgG1和IgG2a水平均升高,以IgG2a占優(yōu)勢(shì)。RT-PCR結(jié)果示,疫苗灌胃免疫后4周,空菌組和重組疫苗組小鼠胃和脾淋巴細(xì)胞IL-2,IFN-γ表達(dá)量顯著增加,PBS對(duì)照組無(wú)IL-2,IFN-γ表達(dá)。受Hp攻擊后4周對(duì)照組和疫苗組小鼠胃組織和脾淋巴細(xì)胞IFN-γ,IL-2和IL-4均有不同程度的的表達(dá),PBS對(duì)照組出現(xiàn)以I

13、FN-γ為主的增生,空菌組出現(xiàn)以IL-2為主的增生,IFN-γ和IL-2水平顯著高于rM.s疫苗組(P<0.05);而rM.s疫苗組則出現(xiàn)以Th2細(xì)胞(IL-4)為主的增生,IL-4水平顯著高于PBS對(duì)照組和空菌對(duì)照組(P<0.05),各實(shí)驗(yàn)組H攻擊前后均未見(jiàn)IL-12,IL-10,IL-6的表達(dá)。 結(jié)論:rM.s疫苗經(jīng)灌胃免疫BLAB/c小鼠后不僅能降低Hp定植,而且能減輕小鼠胃黏膜的局部慢性炎癥反應(yīng),對(duì)Hp感染有明顯的預(yù)防保

14、護(hù)效果。該疫苗的作用機(jī)制可能是誘導(dǎo)Th1和Th2兩種細(xì)胞平衡型免疫應(yīng)答。 第四部分:重組恥垢分枝桿菌活載體疫苗治療幽門(mén)螺桿菌感染的研究。 目的:通過(guò)動(dòng)物模型評(píng)價(jià)重組恥垢分枝桿菌活載體疫苗對(duì)幽門(mén)螺桿菌感染小鼠的治療效果,明確其治療幽門(mén)螺桿菌感染的作用機(jī)制。 方法:建立幽門(mén)螺桿菌感染BALB/c小鼠動(dòng)物模型,感染4周后將2×107 CFUs重組M.s(pPL73-Omp26)疫苗灌胃免疫幽門(mén)螺桿菌感染BALB/c小鼠

15、,對(duì)照組用PBS或M.s空菌,免疫4w后處死小鼠,行胃組織快速尿素酶試驗(yàn),Hp定量培養(yǎng),組織病理學(xué)檢查以評(píng)價(jià)疫苗對(duì)胃黏膜Hp感染的免疫治療作用。MTT檢測(cè)淋巴細(xì)胞增殖;RT-PCR檢測(cè)小鼠胃粘膜和脾組織中Th1細(xì)胞因子(INF-γ、IL-2、IL-12)與Th2細(xì)胞因子(IL-4、IL-6、IL-10)的表達(dá);ELISA檢測(cè)血清Hp特異性抗體IgG,IgA,IgG1和IgG2a水平。 結(jié)果:rM.s(pPL73-Omp26)疫苗

16、治療組小鼠胃黏膜中Hp數(shù)量明顯低于感染對(duì)照組和空菌組,rM.s(pPL73-Omp26)疫苗不僅可以降低Hp的定植,而且能減輕Hp,造成的小鼠胃黏膜的局部慢性炎癥反應(yīng)。治療后四周ConA,刺激后各實(shí)驗(yàn)組脾淋巴細(xì)胞均有不同程度的增殖,與感染對(duì)照組和空菌對(duì)照組相比,rM.s(pPL73-Omp26)疫苗治療組小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖更明顯(P<0.05)。治療后BALB/c小鼠特異性抗體檢測(cè)示rM.s(pPL73-Omp26)疫苗治療組小鼠血清H

17、p特異性抗體IgG,IgA,IgG1和IgG2a均明顯高于感染對(duì)照組和空菌組(P<0.001)。RT-PCR證實(shí),各實(shí)驗(yàn)組胃和脾組織IFN-γ,IL-2,IL-4均有不同程度的表達(dá),但rM.s(pPL73-Omp26)疫苗治療組IFN-γ,IL-2,IL-4水平明顯高于感染對(duì)照組和空菌組,各實(shí)驗(yàn)組均未見(jiàn)IL-6,IL-12和IL-10的表達(dá)。 結(jié)論:成功建立了BALB/c小鼠的Hp感染模型,rM.s(pPL73-Omp26)疫苗

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