幽門螺桿菌外膜蛋白Omp26重組恥垢分枝桿菌活載體疫苗的研究.pdf

1、幽門螺桿菌（Helicobacter pylori，Hp）為定植于人胃黏膜的一種微需氧、螺旋狀的革蘭陰性桿菌，已被公認為是慢性胃炎、胃十二指腸潰瘍的重要病因，并與胃癌、胃黏膜相關(guān)性淋巴樣組織（MALT）淋巴瘤的發(fā)生密切相關(guān)，1994年被世界衛(wèi)生組織定為Ⅰ類致癌原（gradeⅠ carcinogen）。由于Hp的感染率極高，預(yù)防和治療Hp感染成為消化領(lǐng)域和醫(yī)學(xué)微生物界的研究熱點。目前常用的治療方案是抗生素加質(zhì)子泵抑制劑或/及鉍劑的“三聯(lián)”

2、、“四聯(lián)”療法，但藥物治療存在一定的不良反應(yīng)，停藥后易復(fù)發(fā)，治療費用較高，患者依從性差及耐藥菌株的不斷增加等問題使其發(fā)展受到限制，而疫苗將是預(yù)防和治療Hp感染最經(jīng)濟有效的方法。Hp蛋白疫苗的免疫原性較低，只有與各種強效的免疫佐劑一起接種時才具有保護作用，但這些佐劑存在較大的毒副作用而限制了其進一步發(fā)展，而重組活載體疫苗可有效解決這一難題。Hp活載體疫苗為預(yù)防和治療Hp感染提供了一種新的策略。本研究主要分為四個部分： 第一部分：

3、幽門螺桿菌Omp26重組恥垢分枝桿菌活載體疫苗株的構(gòu)建。 目的：采用基因工程技術(shù)構(gòu)建幽門螺桿菌外膜蛋白Omp26大腸桿菌-分枝桿菌穿梭表達載體，并在恥垢分枝桿菌中進行表達，篩選穩(wěn)定表達幽門螺桿菌Omp26的重組恥垢分枝桿菌活載體疫苗株，為進一步探討其防治Hp感染奠定基礎(chǔ)。 方法：利用PCR技術(shù)，以pET32a-Omp26為模板擴增Omp26基因片段，PCR產(chǎn)物膠回收后與載體pMD18-T連接，通過PCR、限制性酶切分析和

4、測序鑒定陽性重組載體，然后將測序正確的重組載體經(jīng)kpnⅠ和NotⅠ雙酶切后亞克隆至大腸桿菌-分枝桿菌穿梭表達載體pLA71、pLA73、pJMas和pJHsp70中，構(gòu)建分泌型和非分泌型大腸桿菌-分枝桿菌穿梭表達載體，利用電穿孔方法將其轉(zhuǎn)入M.s中，構(gòu)建重組恥垢分枝桿菌活載體疫苗株（rM.s），通過PCR、限制性酶切分析鑒定所構(gòu)建的rM.s疫苗株的正確性，SDS-PAGE及Western blot對其表達的蛋白進行分析。 結(jié)果：

5、采用PCR方法從pET32a-Omp26中擴增出約594bp的DNA片段，目的片段與pMD18-T載體連接后測序結(jié)果示插入的基因片段為Hp Omp26編碼基因，由594bp組成，與GenBank中菌株HP AY033499序列同源性達98.8％。將測序正確的重組T載體分別亞克隆入質(zhì)粒pLA71，pLA73，pJMas，pJHsp70中，構(gòu)建分泌性和非分泌性穿梭表達載體，PCR和酶切鑒定穿梭表達載體構(gòu)建成功。將表達載體利用電穿孔的方法導(dǎo)入

6、M.s中，經(jīng)卡那霉素抗性篩選、限制性酶切分析和PCR鑒定rM.s株構(gòu)建成功。重組質(zhì)粒pPL71-Omp26，pPL73-Omp26在M.s中表達的蛋白可分泌到細菌培養(yǎng)上清中，Western blotting在細胞培養(yǎng)上清中能檢測到Omp26。重組質(zhì)粒pJMas-Omp26和pJHsp70-Omp26由于缺乏信號肽，所表達的蛋白僅存在于細菌沉淀中。 結(jié)論：成功構(gòu)建了重組大腸桿菌-分枝桿菌穿梭表達質(zhì)粒pPL71-Omp26，pPL7

7、3-Omp26，pJMas-Omp26和pJHsp70-Omp26；成功構(gòu)建了穩(wěn)定表達幽門螺桿菌Omp26的重組恥垢分枝桿菌活載體疫苗株。 第二部分：幽門螺桿菌Omp26重組恥垢分枝桿菌活載體疫苗株體內(nèi)外穩(wěn)定性及安全性研究 目的：研究幽門螺桿菌Omp26恥垢分枝桿菌活載體疫苗株在小鼠體內(nèi)外的穩(wěn)定性及在小鼠體內(nèi)的定植，并對疫苗的安全性進行評價。 方法：將綠色熒光蛋白質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化入構(gòu)建好的重組恥垢分枝桿菌活載體疫苗中，

8、經(jīng)體外傳代培養(yǎng)，隨機挑取20個菌落觀察熒光表達及提取質(zhì)粒判斷重組質(zhì)粒的穩(wěn)定性；灌胃免疫BALB/c小鼠，免疫4周和8周后處死小鼠，對小鼠各內(nèi)臟器官行組織學(xué)檢查，并對各組織內(nèi)細菌進行活菌計數(shù)及質(zhì)粒提取，以判斷重組恥垢分枝桿菌活載體疫苗體內(nèi)的穩(wěn)定性及安全性。 結(jié)果：體外穩(wěn)定性研究結(jié)果表明重組恥垢分枝桿菌活載體疫苗在體外具有高度穩(wěn)定性，在有卡那霉素抗性存在和無選擇性壓力情況下均可連續(xù)傳代20次而不發(fā)生質(zhì)粒丟失。應(yīng)用rM.s灌胃免疫BA

9、LB/c小鼠后無明顯的毒副作用出現(xiàn)，重組活載體疫苗可穩(wěn)定地存在于胃、脾臟、肺和肝臟。 結(jié)論：綠色熒光蛋白為觀測rM.s在體內(nèi)的定植提供了更為直觀的手段。rM.s在體內(nèi)外具有高度的穩(wěn)定性，無明顯毒副作用。 第三部分：重組恥垢分枝桿菌活載體疫苗預(yù)防幽門螺桿菌感染的研究。 目的：通過動物模型評價重組恥垢分枝桿菌活載體疫苗預(yù)防幽門螺桿菌感染的效果，明確其預(yù)防幽門螺桿菌感染的作用機制。 方法：選擇標(biāo)準(zhǔn)化實驗動物SP

10、F級BALB/c小鼠構(gòu)建Hp定植模型，將2×107 CFUs重組M.s疫苗（pPL73-Omp26）灌胃免疫BALB/c小鼠，同時設(shè)PBS對照組、M.s空菌組，免疫4w后，各組處死一批小鼠，取血清、胃、脾組織待用；余下的小鼠用Hp SS1攻擊2次，4w后處死小鼠，行快速尿素酶試驗，Hp定量培養(yǎng)，組織病理學(xué)檢查以評價疫苗預(yù)防胃黏膜Hp感染的免疫保護作用。MTT檢測脾淋巴細胞增殖；RT-PCR檢測小鼠胃粘膜和脾組織中Th1細胞因子（IFN-

11、γ、IL-2、IL-12）與Th2細胞因子（IL-4、IL-6、IL-10）的表達；ELISA檢測血清Hp特異性IgG，IgA，IgG1和IgG2a抗體水平。 結(jié)果：rM.s（pPL73-Omp26）疫苗組胃黏膜中Hp數(shù)量明顯低于PBS對照組和空菌組，rM.s（pPL73-Omp26）疫苗組不僅可以降低Hp的定植，而且能減輕Hp造成的小鼠胃黏膜的局部慢性炎癥反應(yīng)。用ConA和Hp抗原刺激后rM.s疫苗組小鼠脾淋巴細胞明顯增殖。免

12、疫后BALB/c小鼠特異性抗體顯示rM.s（pPL73-Omp26）疫苗組誘導(dǎo)血清Hp特異性抗體IgG、IgA、IgG1和IgG2a水平均升高，以IgG2a占優(yōu)勢。RT-PCR結(jié)果示，疫苗灌胃免疫后4周，空菌組和重組疫苗組小鼠胃和脾淋巴細胞IL-2，IFN-γ表達量顯著增加，PBS對照組無IL-2，IFN-γ表達。受Hp攻擊后4周對照組和疫苗組小鼠胃組織和脾淋巴細胞IFN-γ，IL-2和IL-4均有不同程度的的表達，PBS對照組出現(xiàn)以I

13、FN-γ為主的增生，空菌組出現(xiàn)以IL-2為主的增生，IFN-γ和IL-2水平顯著高于rM.s疫苗組（P<0.05）；而rM.s疫苗組則出現(xiàn)以Th2細胞（IL-4）為主的增生，IL-4水平顯著高于PBS對照組和空菌對照組（P<0.05），各實驗組H攻擊前后均未見IL-12，IL-10，IL-6的表達。 結(jié)論：rM.s疫苗經(jīng)灌胃免疫BLAB/c小鼠后不僅能降低Hp定植，而且能減輕小鼠胃黏膜的局部慢性炎癥反應(yīng)，對Hp感染有明顯的預(yù)防保

14、護效果。該疫苗的作用機制可能是誘導(dǎo)Th1和Th2兩種細胞平衡型免疫應(yīng)答。 第四部分：重組恥垢分枝桿菌活載體疫苗治療幽門螺桿菌感染的研究。 目的：通過動物模型評價重組恥垢分枝桿菌活載體疫苗對幽門螺桿菌感染小鼠的治療效果，明確其治療幽門螺桿菌感染的作用機制。 方法：建立幽門螺桿菌感染BALB/c小鼠動物模型，感染4周后將2×107 CFUs重組M.s（pPL73-Omp26）疫苗灌胃免疫幽門螺桿菌感染BALB/c小鼠

15、，對照組用PBS或M.s空菌，免疫4w后處死小鼠，行胃組織快速尿素酶試驗，Hp定量培養(yǎng)，組織病理學(xué)檢查以評價疫苗對胃黏膜Hp感染的免疫治療作用。MTT檢測淋巴細胞增殖；RT-PCR檢測小鼠胃粘膜和脾組織中Th1細胞因子（INF-γ、IL-2、IL-12）與Th2細胞因子（IL-4、IL-6、IL-10）的表達；ELISA檢測血清Hp特異性抗體IgG，IgA，IgG1和IgG2a水平。 結(jié)果：rM.s（pPL73-Omp26）疫苗

16、治療組小鼠胃黏膜中Hp數(shù)量明顯低于感染對照組和空菌組，rM.s（pPL73-Omp26）疫苗不僅可以降低Hp的定植，而且能減輕Hp，造成的小鼠胃黏膜的局部慢性炎癥反應(yīng)。治療后四周ConA，刺激后各實驗組脾淋巴細胞均有不同程度的增殖，與感染對照組和空菌對照組相比，rM.s（pPL73-Omp26）疫苗治療組小鼠脾淋巴細胞增殖更明顯（P<0.05）。治療后BALB/c小鼠特異性抗體檢測示rM.s（pPL73-Omp26）疫苗治療組小鼠血清H

17、p特異性抗體IgG，IgA，IgG1和IgG2a均明顯高于感染對照組和空菌組（P<0.001）。RT-PCR證實，各實驗組胃和脾組織IFN-γ，IL-2，IL-4均有不同程度的表達，但rM.s（pPL73-Omp26）疫苗治療組IFN-γ，IL-2，IL-4水平明顯高于感染對照組和空菌組，各實驗組均未見IL-6，IL-12和IL-10的表達。 結(jié)論：成功建立了BALB/c小鼠的Hp感染模型，rM.s（pPL73-Omp26）疫苗