幽門(mén)螺桿菌重組恥垢分枝桿菌疫苗的構(gòu)建及作用機(jī)理研究.pdf

1、背景和目的：幽門(mén)螺桿菌(Helicobacterpylori，Hp)是慢性胃炎和消化性潰瘍的重要病因，與胃癌和胃MALT淋巴瘤的發(fā)病也有密切關(guān)系。目前臨床上常用的三聯(lián)療法不足以根治Hp感染，甚至導(dǎo)致耐藥菌的不斷增多，費(fèi)用昂貴，病人依從性差，容易復(fù)發(fā)。免疫接種是徹底消除Hp感染的有效措施，目前Hp疫苗的研究主要為免疫保護(hù)抗原加佐劑，但效果仍不夠滿(mǎn)意。研究新的疫苗預(yù)防Hp感染已成為當(dāng)前國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。重組活載體疫苗具有無(wú)需純化抗原、無(wú)需佐

2、劑、可避免抗原在胃內(nèi)的降解和變性等優(yōu)點(diǎn)，被認(rèn)為是最有開(kāi)發(fā)和應(yīng)用前景的疫苗。 卡介苗(BacilleCalmette-Gu6rin,BCG)是理想的重組活載體疫苗。近1O年的研究表明，BCG有諸多不足：(1)難于培養(yǎng)；(2)對(duì)多種抗生素有抗藥性；(3)轉(zhuǎn)化率低；(4)對(duì)于免疫力低下者，有可能誘發(fā)致命的結(jié)核病。人們期待著基因工程新載體的出現(xiàn)，許多學(xué)者轉(zhuǎn)向非致病分枝桿菌作為載體的研究。 恥垢分枝桿菌(Mycobacterium

3、smegmatis,M．S)是一類(lèi)快速生長(zhǎng)型分枝桿菌，生長(zhǎng)快，1～3h繁殖1代，M．S既是一種非致病菌又是一種細(xì)胞免疫佐劑，很多外源蛋白能在M．S中表達(dá)。這為進(jìn)一步研究Hp疫苗開(kāi)辟了新的途徑。 我們的研究是：選擇Hp兩個(gè)保守基因UreB和OMPl8分別克隆入大腸桿菌．分枝桿菌穿梭表達(dá)載體中，利用電穿孔的方法將表達(dá)載體導(dǎo)入M．S中，篩選穩(wěn)定表達(dá)的重組M．S菌株；觀察其在小鼠體內(nèi)外的穩(wěn)定性及毒副作用；然后將重組候選疫苗株單獨(dú)或聯(lián)合灌

4、胃免疫BALB／c小鼠，在小鼠模型中評(píng)價(jià)其對(duì)Hp感染的免疫保護(hù)作用，并對(duì)其免疫保護(hù)機(jī)理進(jìn)行探討。為尋求安全、有效、廉價(jià)的Hp新疫苗打下基礎(chǔ)。 方法： 1．首先，利用hsp70、Mas和p一內(nèi)酰胺酶啟動(dòng)子作為M．S中調(diào)控外源性基因表達(dá)的啟動(dòng)子，同時(shí)利用p一內(nèi)酰胺酶的抗原信號(hào)肽作為M．S的外源性基因分泌表達(dá)信號(hào)肽，并將人HpUreBcDNA和OMPl8cDNA分別克隆入載體，構(gòu)建大腸桿菌一分枝桿菌穿梭分泌表達(dá)和非分泌表達(dá)載體

5、。利用電穿孔的方法將表達(dá)載體導(dǎo)入M．S中，經(jīng)Kan抗性篩選、限制性酶切分析和PCR鑒定及SDS-PAGE和Westernblotting分析，篩選高效表達(dá)HpUreB和OMPl8的候選疫苗株。 2．將綠色熒光蛋白質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化入構(gòu)建好的重組疫苗中，經(jīng)體外傳代培養(yǎng)和灌胃免疫BALB／c小鼠，以探索重組疫苗體內(nèi)外的穩(wěn)定性和在小鼠體內(nèi)的定植，并對(duì)疫苗的安全性進(jìn)行研究。 3．將重組M．S疫苗(2×107)單獨(dú)或聯(lián)合灌胃免疫接種BAL

6、B／c小鼠，同時(shí)設(shè)PBS組、M．S空菌組，免疫4w后，各組處死一批小鼠，取血清、胃、脾組織待用；余下的小鼠用HpSSl攻擊2次,4w后處死小鼠，行胃組織快速尿素酶試驗(yàn),Hp培養(yǎng)，炎癥程度及其炎癥活動(dòng)度評(píng)分以評(píng)價(jià)疫苗對(duì)胃黏膜Hp感染的免疫保護(hù)作用。 4．免疫清除機(jī)制探索：攻擊后4w，取血清、胃、脾組織，RT-PCR檢測(cè)小鼠胃粘膜和脾組織的Thl細(xì)胞因子(INF-7、IL-2、IL-12)與Th2細(xì)胞因子(IL-4、IL-6、IL-

7、10)；ELISA檢測(cè)Hp特異性血清IgG.IgGl,IgG2a和IgA水平；免疫組化方法檢測(cè)胃黏膜固有層IgA表達(dá)；MTT檢測(cè)淋巴細(xì)胞增殖。 結(jié)果：1．設(shè)計(jì)了hsp70和Mas引物，采用PCR方法從BCG基因組中擴(kuò)增出相應(yīng)大小的DNA片段，將目的片段與pMDl8-T載體連接后測(cè)序。將測(cè)序正確的hsp70和Mas亞克隆入pJEM¨，檢測(cè)堿性磷酸酶活性，篩選出高效表達(dá)的Mas啟動(dòng)子和p一內(nèi)酰胺酶啟動(dòng)子，然后將已測(cè)序鑒定的Hp基因U

8、reB和OMPl8連接，構(gòu)建分泌性和非分泌性穿梭表達(dá)載體,PCR和酶切鑒定穿梭表達(dá)載體構(gòu)建成功。 2．將表達(dá)載體利用電穿孔的方法導(dǎo)入M．S中，經(jīng)Kan抗性篩選、限制性酶切分析和PCR鑒定以及SDS-PAGE和Westernblotting證實(shí)rM．S株構(gòu)建成功。 3．體外穩(wěn)定性研究結(jié)果表明在有卡那霉素抗性存在的情況下，重組分枝桿菌在體外具有高度穩(wěn)定性，在無(wú)選擇性壓力情況下可連續(xù)傳代20次而不發(fā)生質(zhì)粒丟失。應(yīng)用rM．S灌胃

9、免疫Babl／c小鼠后，顯示重組疫苗可較穩(wěn)定地侵入定居于胃、肺、脾臟和肝臟，并且無(wú)明顯的毒副作用． 4．各疫苗組Hp定植評(píng)分均明顯低于PBS組和空菌組，疫苗組不僅可以降低Yp的定植，而且能減輕Hp造成的小鼠胃黏膜的局部慢性炎癥反應(yīng)，但兩組單價(jià)疫苗組比較未見(jiàn)顯著性差異。雙價(jià)疫苗組較單價(jià)疫苗組更優(yōu)。 5．免疫后BALB／c小鼠特異性抗體顯示rM．S疫苗誘導(dǎo)Hp特異性血清IgG、IgA水平都升高，以IgG2a占優(yōu)勢(shì)。用Hp抗原

10、刺激后各免疫組小鼠脾淋巴細(xì)胞均有明顯增殖。免疫組化顯示各免疫組小鼠胃黏膜固有層IgA陽(yáng)性標(biāo)記腺體數(shù)明顯高于對(duì)照組。 6．RT-PCR證實(shí)，Hp攻擊之前，各免疫組胃和脾組織已出現(xiàn)IFN-7，IL．12，IL-2表達(dá)而無(wú)IL-4，IL-6，IL一10表達(dá)，PBS對(duì)照組胃黏膜和脾組織各細(xì)胞因子均無(wú)表達(dá)；lip攻擊后，PBS和空菌組胃組織出現(xiàn)以Thl細(xì)胞INF-~為主的增生，INF-7水平顯著高于疫苗組(P＜O．05)；而三個(gè)疫苗組脾臟

11、則出現(xiàn)以Th2細(xì)胞(IL-4)為主的增生，IL-4水平顯著高于對(duì)照組(P＜0．05)。提示該疫苗的作用機(jī)制是誘導(dǎo)Thl／Th2平衡型免疫應(yīng)答。 結(jié)論： 1.成功構(gòu)建了pJMB，pLAB，pLUB和pJMO,pLO,pLAO大腸桿菌一分枝桿菌穿梭質(zhì)粒； 2．重組質(zhì)粒pLAO，pJAB和pLUB在M．S中表達(dá)的蛋白可分泌到細(xì)菌培養(yǎng)上清中，Westernblotting在細(xì)胞培養(yǎng)上清中能檢測(cè)到UreB,ompl8。重組

12、質(zhì)粒pJMB和pJMO由于缺乏信號(hào)肽，所表達(dá)的蛋白以非分泌方式表達(dá)。 3．rM．S疫苗經(jīng)灌胃接種BLAB／c小鼠證明能降低Hp定植，減輕胃黏膜的炎癥反應(yīng)，對(duì)Hp感染有明顯的預(yù)防保護(hù)作用，聯(lián)合免疫組效果更顯著。 4．成功地建立了BALB／c小鼠的Hp感染模型，對(duì)rM．S疫苗的免疫保護(hù)機(jī)理研究結(jié)果顯示，rM．S能產(chǎn)生以Thl細(xì)胞和Th2細(xì)胞協(xié)同作用的保護(hù)性免疫應(yīng)答。 5．rM．S在體內(nèi)外均能穩(wěn)定表達(dá)外源蛋白，無(wú)明顯毒

13、副作用。 6．綠色熒光蛋白為重組子的篩選和觀測(cè)rM．S體內(nèi)定植提供了直觀的手段。 本研究首次將重組分枝桿菌系統(tǒng)用于Hp疫苗的研究，構(gòu)建了含有HpUreB基因和HpOMPl8基因的穿梭表達(dá)載體，rM．S免疫接種后可誘發(fā)Thl／Th2平衡型細(xì)胞免疫應(yīng)答，He特異性血清IgG、IgA水平都升高。本研究為研制Hp疫苗提供了重要實(shí)驗(yàn)依據(jù)，雖然從基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)過(guò)渡到臨床應(yīng)用還有一段距離，但相信隨著研究的不斷深入，重組活載體疫苗在Hp的預(yù)防