重組腺病毒介導(dǎo)miR-27b感染內(nèi)皮祖細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、內(nèi)皮祖細(xì)胞(Endothelial progenitor cells，EPCs)是血管內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞，參與血管再生和內(nèi)皮損傷后的修復(fù)過程。EPCs衰老及其功能紊亂可致血管內(nèi)皮功能失調(diào)，后者與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。餐后高甘油三酯血癥患者血漿中增多的殘粒脂蛋白(Remnant-like particles，RLPs)與血管內(nèi)皮功能失調(diào)密切相關(guān)，可加速人外周血單個(gè)核細(xì)胞來源EPCs的衰老進(jìn)程，但其機(jī)制尚不明確。微小RNA(mi

2、croRNA，miRNA)是一類在進(jìn)化過程中高度保守的內(nèi)源性非編碼單鏈RNA，通過在轉(zhuǎn)錄后水平抑制真核生物的基因表達(dá)而參與調(diào)控細(xì)胞分化、生長發(fā)育、凋亡、腫瘤形成等復(fù)雜的病理生理過程。近年來，許多研究發(fā)現(xiàn)miRNA參與調(diào)控細(xì)胞衰老。我們通過前期研究發(fā)現(xiàn):RLPs誘導(dǎo)的衰老小鼠EPCs中miRNA-27b(miR-27b)表達(dá)顯著下調(diào)。推測(cè)miR-27b可能參與調(diào)控RLPs誘導(dǎo)的EPCs衰老。
　　 目的:
　　 利用細(xì)菌內(nèi)

3、同源重組法構(gòu)建以綠色熒光蛋白(EGFP)為報(bào)告基因、含miR-27b基因的重組腺病毒，導(dǎo)入小鼠內(nèi)皮祖細(xì)胞中表達(dá)，為進(jìn)一步研究miR-27b在RLPs誘導(dǎo)的EPCs衰老中的作用奠定基礎(chǔ)。
　　 方法:
　　 利用密度梯度離心法分離小鼠骨髓中單個(gè)核細(xì)胞，差速貼壁結(jié)合EBM-2培養(yǎng)基擴(kuò)增細(xì)胞，誘導(dǎo)單個(gè)核細(xì)胞分化為EPCs。流式細(xì)胞技術(shù)鑒定EPCs。將含有目的基因miR-27b的質(zhì)粒與目的載體pDC316-siRNA分別進(jìn)行酶切

4、。酶切產(chǎn)物瓊脂糖電泳回收后進(jìn)行定向連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入細(xì)菌感受態(tài)細(xì)胞BJ5183。先對(duì)生長的克隆進(jìn)行菌落PCR鑒定，再對(duì)PCR鑒定陽性的克隆進(jìn)行測(cè)序和比對(duì)分析，比對(duì)分析正確的克隆即為構(gòu)建成功的目的質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒在人胚腎293細(xì)胞（HEK293）中包裝、擴(kuò)增出miR-27b重組腺病毒載體(Ad-miR-27b)，檢測(cè)其滴度;以腺病毒載體綠色熒光蛋白(Ad-EGFP)為陰性對(duì)照，分別感染EPCs，RT-PCR檢測(cè)感染后miR-27b的表達(dá)情

5、況。
　　 結(jié)果:
　　 經(jīng)密度梯度離心和差速貼壁法分離所得的細(xì)胞經(jīng)EBM-2專用培養(yǎng)基培養(yǎng)后，培養(yǎng)到第12d行流式細(xì)胞儀檢測(cè)其CD34、CD133、Flk-1、CD31的陽性率分別為（65±4）％、（48±3）％、（37±3）％和（51±4）％。目的基因miR-27b的質(zhì)粒與目的載體pDC316-siRNA雙酶切后共轉(zhuǎn)化BJ5183感受態(tài)菌，可獲得陽性重組體細(xì)菌克隆。重組質(zhì)粒在人胚腎293細(xì)胞(HEK293)中包裝、擴(kuò)