重組腺病毒介導(dǎo)人肝細(xì)胞生長因子基因修復(fù)周圍神經(jīng)損傷的實驗研究.pdf

1、研究背景：周圍神經(jīng)缺損的修復(fù)以自體神經(jīng)移植效果最佳。但可供移植的自體神經(jīng)來源有限，且切取后有供區(qū)麻木、疤痕、神經(jīng)瘤等并發(fā)癥，故難以滿足粗大、長段神經(jīng)缺損修復(fù)的需要?；瘜W(xué)去細(xì)胞同種異體神經(jīng)是新型生物組織工程材料--免疫源性低、內(nèi)部天然結(jié)構(gòu)保留完整，可以引導(dǎo)宿主許旺細(xì)胞遷移并促進(jìn)軸突再生，已逐漸成為自體神經(jīng)移植較理想的替代物。目前比較棘手的難題是神經(jīng)缺損修復(fù)后，神經(jīng)再生的質(zhì)量和速度不盡人意。周圍神經(jīng)損傷修復(fù)后，能否成功再生主要取決于是否具有

2、適合其生長的微環(huán)境條件。包括肝細(xì)胞生長因子(HGF)在內(nèi)的神經(jīng)營養(yǎng)因子(neurotrophicfactors，NTFs)是再生微環(huán)境中的重要因素，對再生神經(jīng)的生長和走向起重要的營養(yǎng)和誘導(dǎo)作用。外周神經(jīng)系統(tǒng)損傷后，內(nèi)源性HGF表達(dá)的增加可以保護(hù)神經(jīng)元，加快軸突的生長，促進(jìn)神經(jīng)纖維的修復(fù)。但是由于其存在時間及濃度有限，加之外源性的HGF重組蛋白純化困難，半衰期短--都不能完全滿足神經(jīng)再生的需要?；蚣夹g(shù)是提供神經(jīng)營養(yǎng)因子的良好工具，它可以

3、將目的基因提供給受損部位并持續(xù)表達(dá)，促進(jìn)神經(jīng)生長。本研究將腺病毒載體介導(dǎo)的人肝細(xì)胞生長因子基因局部注射，通過骨骼肌細(xì)胞的轉(zhuǎn)染，持續(xù)表達(dá)目的蛋白(HGF)--觀察其在周圍神經(jīng)損傷修復(fù)中的可行性及對神經(jīng)生長的作用，為進(jìn)一步的臨床試驗提供依據(jù)。 方法： (1)檢測攜帶人肝細(xì)胞生長因子基因的重組腺病毒(Ad-HGF)體外對小鼠骨骼肌細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率以及轉(zhuǎn)染細(xì)胞對目的蛋白的表達(dá)。以不同感染復(fù)數(shù)(M．O．I)(0、50、100、200

4、、400)的Ad-GFP(攜帶綠色熒光蛋白基因的腺病毒)感染骨骼肌細(xì)胞，48小時后用流式細(xì)胞儀檢測轉(zhuǎn)染效率Ad-HGF(MOI=400 pfu/cell)轉(zhuǎn)染小鼠骨骼肌細(xì)胞，每48h收集培養(yǎng)上清，對照組轉(zhuǎn)染Ad-GFP，ELISA法檢測上清中HGF的表達(dá)，持續(xù)至第14天。 (2)化學(xué)去細(xì)胞同種異體神經(jīng)修復(fù)Wistar大鼠坐骨神經(jīng)10mm缺損后，近、遠(yuǎn)端吻合口附近肌肉分別注射腺病毒介導(dǎo)的人肝細(xì)胞生長因子(異體神經(jīng)+HGF組)，與自

5、體神經(jīng)移植組和無HGF作用異體神經(jīng)組(異體神經(jīng)組)對照，通過步態(tài)分析、肌肉濕重測定、軸突生長速率測定、神經(jīng)電生理、計算機圖像分析等指標(biāo)評價神經(jīng)移植后再生效果。 (3)以Wistar大鼠坐骨神經(jīng)擠挫傷(Crush)為動物模型，神經(jīng)損傷局部肌肉注射腺病毒介導(dǎo)的人肝細(xì)胞生長因子(Crush+HGF組)，與無注射HGF組(Crush組)對照，通過步態(tài)分析、肌肉濕重測定、計算機圖像分析等指標(biāo)評價神經(jīng)損傷后再生效果。 (4)借鑒Hu

6、dson發(fā)明的異體神經(jīng)化學(xué)萃取方法(簡稱Hudson法)，綜合應(yīng)用萃取劑TritonX-200、SB-10和SB-16對犬坐骨神經(jīng)的化學(xué)處理方法進(jìn)行改良，并與Sondell發(fā)明的異體神經(jīng)化學(xué)萃取方法(簡稱Sondell法)(應(yīng)用萃取劑Triton X-100和脫氧膽酸鈉)進(jìn)行比較，從細(xì)胞、髓鞘的去除，結(jié)構(gòu)完整性保存等方面綜合評價移植物的質(zhì)量，建立一種新型的神經(jīng)萃取方法。 (5)按照第四部分建立的神經(jīng)萃取方法制備犬去細(xì)胞異體神經(jīng)，

7、修復(fù)犬坐骨神經(jīng)5厘米缺損；近、遠(yuǎn)端吻合口附近肌肉分別注射腺病毒介導(dǎo)的人肝細(xì)胞生長因子(異體神經(jīng)+HGF組)，與自體神經(jīng)移植組和無HGF作用異體神經(jīng)組(異體神經(jīng)組)對照，通過神經(jīng)電生理、組織學(xué)觀察、計算機圖像分析等指標(biāo)評價神經(jīng)移植后再生效果。 結(jié)果： (1)在Ad-GFP轉(zhuǎn)染骨骼肌細(xì)胞48h時，GFP的表達(dá)明顯增強，熒光顯微鏡觀察可見綠色熒光。流式細(xì)胞儀檢測轉(zhuǎn)染效率：隨著MOI的增大，轉(zhuǎn)染效率明顯提高。骨骼肌細(xì)胞轉(zhuǎn)染HGF

8、后，ELISA法定期檢測其表達(dá)。48h時，HGF的表達(dá)與對照組相比明顯增加，可達(dá)131ng/mL。隨著時間的推移，表達(dá)量開始降低，第8d明顯降低，隨后維持一個相對穩(wěn)定的水平。 (2)術(shù)后16周同自體神經(jīng)移植對比，去細(xì)胞異體神經(jīng)可以修復(fù)大鼠周圍神經(jīng)缺損。在步態(tài)分析、肌肉濕重測定、軸突生長速率測定、計算機圖像分析等指標(biāo)評價中，異體神經(jīng)+HGF組與異體神經(jīng)組的差異具有明顯統(tǒng)計學(xué)意義，異體神經(jīng)+HGF組與自體神經(jīng)移植組的差異沒有統(tǒng)計學(xué)意

9、義。神經(jīng)移植體內(nèi)新生血管面積與移植物橫截面積比例的比較，異體神經(jīng)+HGF組與異體神經(jīng)組和自體神經(jīng)移植組的差異分別具有明顯統(tǒng)計學(xué)意義。 (3)術(shù)后4周，在步態(tài)分析、肌肉濕重測定、軸突生長速率測定、計算機圖像分析等指標(biāo)評價中，Crush+HGF組與Crush組的差異具有明顯統(tǒng)計學(xué)意義。 (4)通過組織學(xué)觀察和綜合質(zhì)量評分比較，改良Hudson法組制備的犬去細(xì)胞異體神經(jīng)，可以在去除許旺細(xì)胞、髓鞘等免疫源性物質(zhì)的同時較好地保留基

10、底膜管結(jié)構(gòu)。 (5)盡管采取石膏、假肢固定等保護(hù)措施，仍不能避免動物自虐，舔食患趾。因不能觀察患肢功能恢復(fù)，提前宰殺術(shù)犬5只，僅剩余一只。術(shù)后6月神經(jīng)電生理和組織學(xué)觀察表明，再生神經(jīng)纖維已經(jīng)通過近遠(yuǎn)端吻合口。 結(jié)論： (1)攜帶人肝細(xì)胞生長因子基因的重組腺病毒(Ad-HGF)的構(gòu)建是成功的，體外實驗顯示了其生物學(xué)活性，為基因治療的臨床應(yīng)用提供了實驗依據(jù)。 (2)復(fù)合肝細(xì)胞生長因子的化學(xué)去細(xì)胞異體神經(jīng)能促進(jìn)

11、神經(jīng)軸突生長速度，顯著增加移植物內(nèi)新生血管，滿意修復(fù)一定長度周圍神經(jīng)缺損，可以成為一種有效的周圍神經(jīng)組織工程修復(fù)材料。 (3)肝細(xì)胞生長因子能促進(jìn)大鼠坐骨神經(jīng)損傷后的有髓纖維再生和功能恢復(fù)，是一種有效的治療周圍神經(jīng)損傷的神經(jīng)營養(yǎng)因子。 (4)綜合運用萃取劑Triton X-200、SB-10和SB-16的化學(xué)萃取方法，是一種較為理想的去細(xì)胞異體神經(jīng)制備方法，能夠制備出免疫物質(zhì)清除徹底、神經(jīng)結(jié)構(gòu)保存較好的犬去細(xì)胞異體神經(jīng)移