新型神經(jīng)導(dǎo)管復(fù)合材料與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞用于周圍神經(jīng)缺損的基礎(chǔ)研究.pdf

1、一、研究背景:
　　 周圍神經(jīng)缺損的修復(fù)與重建是目前世界性的難題，臨床治療的金標(biāo)準(zhǔn)是自體神經(jīng)移植，但存在供體來源有限、供區(qū)感覺及運(yùn)動(dòng)功能受損等弊端，因此探索周圍神經(jīng)損傷修復(fù)的新方法具有重要意義。組織工程學(xué)研究為解決這一問題提供了新思路。種子細(xì)胞和導(dǎo)管支架制成的復(fù)合體是構(gòu)建組織工程的核心。目前，組織工程中應(yīng)用較多的種子細(xì)胞有:雪旺細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、骨骼肌干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞以及胚胎干細(xì)胞等。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchym

2、al stemcells，MSCs)是細(xì)胞治療中常用的一種，具有自我更新和多向分化的潛能，在適宜的培養(yǎng)條件下，能夠在體外穩(wěn)定的生存和繁殖，并能保持多向分化能力，是體外操作的理想細(xì)胞。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為雪旺細(xì)胞和神經(jīng)元樣細(xì)胞能分泌神經(jīng)生長(zhǎng)因子，對(duì)神經(jīng)修復(fù)有促進(jìn)作用。另外，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞取材容易，且能在體外迅速增殖和誘導(dǎo)分化，移植后可以在免疫豁免區(qū)存活，避免了免疫排斥反應(yīng)，因而用于周圍神經(jīng)損傷的修復(fù)治療研究，具有廣闊的應(yīng)用前景。<

3、br>　　 目前導(dǎo)管材料主要包括:生物型神經(jīng)導(dǎo)管、人工合成導(dǎo)管、復(fù)合組織導(dǎo)管。導(dǎo)管材料作為人工細(xì)胞外基質(zhì)為細(xì)胞提供賴以粘附、生長(zhǎng)、分化、和增殖的場(chǎng)所，有利進(jìn)行正常新陳代謝。許多研究表明，神經(jīng)再生過程中，斷端的神經(jīng)再生和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、神經(jīng)生長(zhǎng)因子等的作用關(guān)系密切，當(dāng)神經(jīng)缺損超過一定距離后，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)缺乏，導(dǎo)致遠(yuǎn)端和近端不能重新連接。前期課題組自行設(shè)計(jì)并合成了精氨酸-甘氨酸-天門冬氨酸多肽接枝聚（羥基乙酸-L-賴氨酸-乳酸）/聚乳酸/β

4、-磷酸三鈣/神經(jīng)生長(zhǎng)因子緩釋導(dǎo)管，并用于修復(fù)大鼠10mm坐骨神經(jīng)缺損，結(jié)果表明該導(dǎo)管對(duì)大鼠坐骨神經(jīng)缺損具有良好的橋梁作用和促進(jìn)神經(jīng)生長(zhǎng)的作用，而且動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明該新型神經(jīng)導(dǎo)管復(fù)合材料沒有細(xì)胞毒性。
　　 本實(shí)驗(yàn)通過定向誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為神經(jīng)樣細(xì)胞，鑒定其特異性標(biāo)志物的表達(dá)，并將其作為種子細(xì)胞加入神經(jīng)導(dǎo)管中，制成新型導(dǎo)管復(fù)合材料。
　　 二、研究目的
　　 1、前期課題組從仿生設(shè)計(jì)的角度出發(fā)，以神經(jīng)基底膜結(jié)構(gòu)

5、與組成的分析研究為基礎(chǔ)，將生物可吸收PDLLA作為基本骨架材料，添加能夠促進(jìn)神經(jīng)生長(zhǎng)的PRGD成分及能誘導(dǎo)神經(jīng)生長(zhǎng)的NGF，添加能調(diào)整置入?yún)^(qū)PH值的β-TCP成分，成功構(gòu)建出PRGD/PDLLA/NGF/β-TCP新型神經(jīng)導(dǎo)管復(fù)合材料，目的旨在通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)其細(xì)胞親和性和緩釋性能。
　　 2、在體外條件下分離、提純鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymalstem cells，BMSCs)并傳代培養(yǎng)

6、，加入堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(Basicfibroblast growth factor，bFGF)和表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor，EGF)對(duì)第三代BMSCs進(jìn)行誘導(dǎo)，觀察細(xì)胞形態(tài)變化，并用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)誘導(dǎo)分化后的神經(jīng)樣細(xì)胞標(biāo)志物;分化為神經(jīng)樣細(xì)胞，目的旨在通過細(xì)胞試驗(yàn)評(píng)價(jià)骨髓間充質(zhì)干那細(xì)胞誘導(dǎo)分化為神經(jīng)樣細(xì)胞的可行性。作為周圍神經(jīng)損傷修復(fù)的基礎(chǔ)研究;
　　 3、在驗(yàn)證新型神經(jīng)導(dǎo)管具有良好

7、的細(xì)胞親和性和緩釋性能以及堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(Basic fibroblast growth factor，bFGF)和表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor，EGF)能誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為神經(jīng)樣細(xì)胞的基礎(chǔ)上，將新型神經(jīng)導(dǎo)管復(fù)合材料和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞制成復(fù)合體，通過體外細(xì)胞生物學(xué)評(píng)價(jià)二者的生物相容性和評(píng)估其用于修復(fù)大動(dòng)物長(zhǎng)段周圍神經(jīng)缺損的可能性，為下一階段動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究和臨床應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。
　　

8、 三、實(shí)驗(yàn)方法
　　 1、新型神經(jīng)導(dǎo)管復(fù)合材料的設(shè)計(jì)與制備
　　 從仿生設(shè)計(jì)的角度考慮，首先以神經(jīng)基底膜結(jié)構(gòu)與組成的分析研究為基礎(chǔ)，自行設(shè)計(jì)并合成了RGD多肽接枝的高分子聚(羥基乙酸-L-賴氨酸-乳酸)(PRGD)，以乙酸乙酯為溶劑，分別加入濃度為85％、相對(duì)分子質(zhì)量為10×104～25×104的聚乳酸(PDLLA)，濃度為10％的PRGD，濃度為5％、平均粒徑小于500nm的β-磷酸三鈣(β-TCP)以及微量神經(jīng)生長(zhǎng)因

9、子(NGF)，經(jīng)超聲波分散，磁力攪拌，采用溶劑揮發(fā)法制備PRGD/PDLLA/β-TCP/NGF復(fù)合成膜。
　　 2、鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、純化及傳代
　　 SD大鼠10％水合氯醛腹腔注射，麻醉后體積分?jǐn)?shù)75％乙醇浸泡30min，置于超凈工作臺(tái)上，嚴(yán)格無菌操作下取大鼠雙側(cè)股骨和脛骨，將骨骺端剪去，暴露兩端骨髓腔，用5ml注射器抽取DMEM液反復(fù)沖洗骨髓腔，至骨皮質(zhì)發(fā)白，收集沖洗液于無菌離心管中，1000r/min離心

10、10min，棄去上清液，重懸，計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度107L-1接種于培養(yǎng)瓶中，加入培養(yǎng)液(含10％胎牛血清、青霉素100U/ml、鏈霉素100g/L)，置于37℃、5％CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱孵育。24h后換液并去除未貼壁的細(xì)胞，后每3天換液一次，至細(xì)胞基本鋪滿瓶底用0.25％胰酶消化，按1∶2比例傳代，進(jìn)行擴(kuò)增、純化培養(yǎng)。每日用倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)及生長(zhǎng)情況。
　　 3、BMSCs誘導(dǎo)分化及鑒定
　　 3.1BMSC

11、s的增殖和誘導(dǎo)分化;
　　 將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的第3代細(xì)胞用0.25％胰酶消化，收集細(xì)胞并調(diào)整密度1×105L-1接種于24孔培養(yǎng)板內(nèi)，分為誘導(dǎo)組和對(duì)照組，各設(shè)6個(gè)復(fù)孔，置于37℃，5％ CO2飽和濕度下孵育。24h后棄培養(yǎng)基，誘導(dǎo)組加入誘導(dǎo)劑（含20ng/mlEGF、20ng/mlbFGF的DMEM培養(yǎng)液）培養(yǎng)，對(duì)照則繼續(xù)用含10％胎牛血清DMEM培養(yǎng)，每3天換液1次，連續(xù)培養(yǎng)7天，每日用倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化及生長(zhǎng)情況。

12、
　　 3.2細(xì)胞免疫組織化學(xué)鑒定
　　 誘導(dǎo)7天后，取出培養(yǎng)板做免疫組織化學(xué)鑒定，一抗分別為兔抗鼠NSE和β-Tubulin和兔抗鼠 GFAP;二抗為異硫氰酸熒光素(fluorescein5(6)-isothiocyanate，F(xiàn)ITC)。步驟為:吸棄培養(yǎng)液，4％多聚甲醛固定10min;0.3％Triton-X100透膜10min，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffersaline，PBS)沖洗3次，山羊血清封

13、閉20min，滴加一抗(1∶200)4℃孵育過夜，PBS沖洗3次，滴加二抗(1∶100)37℃孵育30min，隨機(jī)選擇10個(gè)視野，觀察誘導(dǎo)細(xì)胞染色陽性的細(xì)胞數(shù)。主要觀察指標(biāo):①骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的形態(tài)特性;②骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞分化過程中的形態(tài)變化;③NSE、β-Tubulin、GFAP的表達(dá)情況。
　　 4、新型神經(jīng)導(dǎo)管復(fù)合材料浸提液的制備
　　 稱取滅菌過的精氨酸-甘氨酸-天門冬氨酸多肽接枝聚（羥基乙酸-L-賴氨

14、酸-乳酸）/聚乳酸/β-磷酸三鈣/神經(jīng)生長(zhǎng)因子復(fù)合材料100 mg裝入15 mL離心管，然后加入3 mL細(xì)胞培養(yǎng)液。將離心管置于37℃恒溫振蕩培養(yǎng)箱(100r/min)，24 h后取出浸提液，按1∶9稀釋比例加入α-MEM培養(yǎng)液內(nèi)混勻，浸提液制備過程確保無菌。
　　 5、新型神經(jīng)導(dǎo)管復(fù)合材料與BMSCs相容性研究
　　 5.1MTT法檢測(cè)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞活性
　　 將生長(zhǎng)良好的第3代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞以5×104m

15、l-1密度接種于96孔培養(yǎng)板，分實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組和空白組（只加培養(yǎng)液，不含細(xì)胞，用于調(diào)零），實(shí)驗(yàn)組加精氨酸-甘氨酸-天門冬氨酸多肽接枝聚（羥基乙酸-L-賴氨酸-乳酸）/聚乳酸/β-磷酸三鈣/神經(jīng)生長(zhǎng)因子復(fù)合膜浸提液0.2 mL，對(duì)照組加含體積分?jǐn)?shù)10％胎牛血清的培養(yǎng)液0.2mL，置于37℃，體積分?jǐn)?shù)5％CO2飽和濕度下孵育。隔天半量換液，連續(xù)培養(yǎng)7d。分別取培養(yǎng)1，3，5，7d細(xì)胞進(jìn)行MTT法檢測(cè)（詳細(xì)步驟參考），在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上選擇5

16、70 nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光度值，記錄實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。
　　 5.2流式細(xì)胞儀Annexin V-FITC/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率
　　 將生長(zhǎng)良好的第3代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板，分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組加精氨酸-甘氨酸-天門冬氨酸多肽接枝聚（羥基乙酸-L-賴氨酸-乳酸）/聚乳酸/β-磷酸三鈣/神經(jīng)生長(zhǎng)因子復(fù)合材料浸提液2 mL，對(duì)照組加含體積分?jǐn)?shù)10％胎牛血清的培養(yǎng)液2 mL，37℃，體積分?jǐn)?shù)5％CO2飽和濕度下孵育

17、。每2d換液1次，連續(xù)培養(yǎng)7d，分別取培養(yǎng)1，3，5，7 d細(xì)胞進(jìn)行AnnexinV-FITC/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，記錄實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和流式散點(diǎn)圖，左上象限(FITC-/PI+)為機(jī)械損傷細(xì)胞，左下象限(FITC-/PI-)為正常活細(xì)胞，右上象限(FITC+/PI+)為晚期凋亡或死亡細(xì)胞，右下象限(FITC+/PI-)為早期凋亡細(xì)胞。（細(xì)胞凋亡率由儀器自動(dòng)計(jì)算）。
　　 5.3掃面電鏡觀察BMSCs
　　 將無菌的精氨酸

18、-甘氨酸-天門冬氨酸多肽接枝聚（羥基乙酸-L-賴氨酸-乳酸）/聚乳酸/β-磷酸三鈣/神經(jīng)生長(zhǎng)因子復(fù)合膜剪成12孔培養(yǎng)板孔洞大小，與細(xì)胞濃度為1×109 L-1骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞共同置于12孔培養(yǎng)板中，37℃、體積分?jǐn)?shù)5％CO及飽和濕度條件下孵育。將培養(yǎng)7d后的材料取出，PBS沖洗3次，體積分?jǐn)?shù)2.5％戊二醛4℃固定1h。體積分?jǐn)?shù)30％，50％，75％，80％，90％，100％叔丁醇脫水，前4級(jí)脫水各1次，每次10min，后2級(jí)脫水各2次，

19、每次10 min。保留樣本內(nèi)叔丁醇-20℃冰凍冷藏4h，干燥12 h;噴金，在掃描電鏡下觀察材料表面細(xì)胞生長(zhǎng)狀況。
　　 6、主要觀察指標(biāo)
　　 6.1NSE、β-Tubulin、GFAP的表達(dá)情況。
　　 6.2 BMSCs在浸提液中生長(zhǎng)情況、細(xì)胞活力及細(xì)胞凋亡率;
　　 7、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
　　 結(jié)果用x±s表示，應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05

20、為差異有顯著性意義。
　　 四、結(jié)果
　　 1、成功制備出PRGD/PDLLA/β-TCP/NGF神經(jīng)導(dǎo)管，外觀呈乳白色，無嗅，無味。材料表面光滑、無裂紋、無毛刺，質(zhì)地柔軟，可折彎，易于縫合。體外培養(yǎng)與RSC96細(xì)胞具有較好的細(xì)胞親和性，并可持續(xù)釋放NGF30天以上。
　　 2、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)及誘導(dǎo):原代BMSCs接種24h內(nèi)開始出現(xiàn)貼壁現(xiàn)象，此時(shí)細(xì)胞大多數(shù)為圓形。72h后貼壁細(xì)胞有偽足伸出，大多數(shù)細(xì)胞呈

21、梭形并伴有2～3個(gè)突起，細(xì)胞核較大，圓扁形，可見1～2個(gè)核仁。經(jīng)過三代純化培養(yǎng)后得到的BMSCs形態(tài)為長(zhǎng)梭形，形成多個(gè)突起并彼此發(fā)生聯(lián)系，完全融合后排列成漩渦狀、網(wǎng)狀、輻射狀結(jié)構(gòu)。BMSCs經(jīng)bFGF和EGF誘導(dǎo)24h后，部分細(xì)胞增殖呈團(tuán)簇狀。繼續(xù)培養(yǎng)72h后可見部分細(xì)胞發(fā)出兩個(gè)或多個(gè)突起，胞質(zhì)回縮，胞體呈多角形或不規(guī)則形，折光性明顯增強(qiáng)。培養(yǎng)7天后可見星狀細(xì)胞數(shù)目逐漸增多，細(xì)胞突起之間相互連接成網(wǎng)狀，可見細(xì)胞核及核仁。
　　

22、3、細(xì)胞免疫組織化學(xué)鑒定NSE、β-Tubulin、GFAP表達(dá):BMSCs經(jīng)誘導(dǎo)分化7天后，部分有核細(xì)胞呈現(xiàn)典型的神經(jīng)元樣改變并表達(dá)NSE和β-Tubulin陽性，表明其具有神經(jīng)干細(xì)胞特性，GFAP染色結(jié)果陰性。
　　 4、精氨酸-甘氨酸-天門冬氨酸多肽接枝聚（羥基乙酸-L-賴氨酸-乳酸）/聚乳酸/β-磷酸三鈣/神經(jīng)生長(zhǎng)因子浸提液對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞活力的影響:實(shí)驗(yàn)采用MTT法檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞吸光度值，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在共培養(yǎng)后

23、5，7d，實(shí)驗(yàn)組的吸光度值明顯高于對(duì)照組(P＜0.05)。根據(jù)吸光度值描繪的生長(zhǎng)曲線發(fā)現(xiàn)，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組吸光度值逐漸增大，表明細(xì)胞活性逐漸增加，實(shí)驗(yàn)組吸光度值明顯大于對(duì)照組，即實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞活性高于對(duì)照組。表明精氨酸-甘氨酸-天門冬氨酸多肽接枝聚（羥基乙酸-L-賴氨酸-乳酸）/聚乳酸/β-磷酸三鈣/神經(jīng)生長(zhǎng)因子浸提液對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞不但無毒性作用，還能增加細(xì)胞活性。
　　 5、精氨酸-甘氨酸-天門冬氨酸多肽接枝

24、聚（羥基乙酸-L-賴氨酸-乳酸）/聚乳酸/β-磷酸三鈣/神經(jīng)生長(zhǎng)因子浸提液對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞凋亡的影響:流式細(xì)胞儀Annexin V-FITC/PI雙染法檢測(cè)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組（四組都取上午9點(diǎn)時(shí)間段測(cè)試）細(xì)胞凋亡率為(6.43±3.02)％;對(duì)照組細(xì)胞凋亡率為(16.36±6.88)％，兩組比較差異有顯著性意義(P＜0.05);共培養(yǎng)7d，流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組右上象限晚期凋亡細(xì)胞數(shù)明顯較對(duì)照組少，而細(xì)胞活性明顯大于對(duì)照組。同樣證

25、明精氨酸-甘氨酸-天門冬氨酸多肽接枝聚（羥基乙酸-L-賴氨酸-乳酸）/聚乳酸/β-磷酸三鈣/神經(jīng)生長(zhǎng)因子浸提液對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞無毒性作用，能延長(zhǎng)細(xì)胞存活時(shí)間，具有良好的細(xì)胞相容性。
　　 6、精氨酸-甘氨酸-天門冬氨酸多肽接枝聚（羥基乙酸-L-賴氨酸-乳酸）/聚乳酸/β-磷酸三鈣/神經(jīng)生長(zhǎng)因子復(fù)合材料對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生長(zhǎng)的影響:掃描電鏡觀察見共培養(yǎng)7d，精氨酸-甘氨酸-天門冬氨酸多肽接枝聚（羥基乙酸-L-賴氨酸-乳酸）/聚乳

26、酸/β-磷酸三鈣/神經(jīng)生長(zhǎng)因子復(fù)合材料部分降解，其表面細(xì)胞數(shù)較多，細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，體積較大，胞體發(fā)出多個(gè)突起，并且細(xì)胞之間相互連接交織成網(wǎng)狀，其軸突較長(zhǎng)和較粗，呈典型的神經(jīng)元樣細(xì)胞表現(xiàn)，見圖6，說明其降解產(chǎn)物無細(xì)胞毒性，釋放的神經(jīng)生長(zhǎng)因子具有促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化的作用，細(xì)胞相容性良好。
　　 五、結(jié)論
　　 1、通過對(duì)天然神經(jīng)基底膜成分的仿生，成功制備出PRGD/PDLLA/β-TCP/NGF神經(jīng)導(dǎo)管

27、，體外實(shí)驗(yàn)表明該材料具有良好的生物相容性和細(xì)胞親和性，并能持續(xù)釋放NGF達(dá)30天。
　　 2、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞具有較強(qiáng)的自我增殖和分化潛能，在適宜的體外條件可誘導(dǎo)分化為神經(jīng)樣細(xì)胞，為周圍神經(jīng)損傷修復(fù)的研究提供了新思路。
　　 3、試驗(yàn)充分證明精氨酸-甘氨酸-天門冬氨酸多肽接枝聚（羥基乙酸-L-賴氨酸-乳酸）/聚乳酸/β-磷酸三鈣/神經(jīng)生長(zhǎng)因子復(fù)合材料與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞具有良好的細(xì)胞相容性，可作為優(yōu)良的載體用于構(gòu)建人工仿生