骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療藥物性聾的基礎(chǔ)研究.pdf

1、感音神經(jīng)性聾主要由耳蝸毛細(xì)胞或聽(tīng)覺(jué)神經(jīng)病變引起。毛細(xì)胞位于耳蝸內(nèi)，是高度特異性機(jī)械感受器，其功能障礙、損傷甚至缺失是耳蝸病變引起感音神經(jīng)性聾的主要原因。相對(duì)于非哺乳動(dòng)物，哺乳動(dòng)物毛細(xì)胞損傷后不能自發(fā)再生，由此引起的聽(tīng)力損失難以恢復(fù)。應(yīng)用干細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞替代治療是毛細(xì)胞缺失后恢復(fù)聽(tīng)力的一個(gè)主要治療策略。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞易于收集和增殖、能夠自體移植、無(wú)臨床應(yīng)用倫理問(wèn)題和免疫障礙，具有多潛能性，是目前進(jìn)行干細(xì)胞替代治療的主要干細(xì)胞來(lái)源。體外研究

2、顯示骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在一定細(xì)胞蛋白作用下具有很強(qiáng)的可塑性，能夠分化為神經(jīng)元細(xì)胞類型。但是，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞能否分化為內(nèi)耳毛細(xì)胞或前體細(xì)胞，干細(xì)胞移植到內(nèi)耳能否存活和分化，能否替代損傷的聽(tīng)毛細(xì)胞，這些都還不清楚。
　　 本課題對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外定向誘導(dǎo)分化耳蝸毛細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞內(nèi)耳導(dǎo)入正常和藥物性聾耳蝸內(nèi)的存活和分化情況進(jìn)行了研究。本研究共分為兩部分：
　　 第一部分 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化為毛細(xì)胞樣細(xì)

3、胞
　　 目的：探討骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外定向分化為耳蝸毛細(xì)胞的可行性。
　　 方法：1、體外分離培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，觀察不同換液方式對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞純化和增殖的影響；RT-PCR檢測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞表面分子表達(dá)；定向誘導(dǎo)培養(yǎng)細(xì)胞向成脂細(xì)胞、成骨細(xì)胞方向分化。2、采取不同細(xì)胞誘導(dǎo)因子定向誘導(dǎo)培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞地向分化為內(nèi)耳毛細(xì)胞，培養(yǎng)后細(xì)胞進(jìn)行免疫組化鑒定和掃描電鏡觀察。
　　 結(jié)果：1、24小時(shí)首次半量換液可使分離

4、細(xì)胞在7天內(nèi)迅速增殖鋪滿細(xì)胞培養(yǎng)皿，培養(yǎng)細(xì)胞表面分子SH2、CD31、CD44呈陽(yáng)性表達(dá)，但不表達(dá)CD34，培養(yǎng)細(xì)胞可分別向脂肪細(xì)胞及成骨方向分化。2、體外骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)后呈現(xiàn)神經(jīng)干細(xì)胞樣形態(tài)并表達(dá)其特異性標(biāo)志Nestin，繼續(xù)誘導(dǎo)分化表達(dá)內(nèi)耳毛細(xì)胞特異性標(biāo)志MyosinⅦa，電鏡觀察可見(jiàn)細(xì)胞表面長(zhǎng)出微絨毛，類似毛細(xì)胞的靜纖毛。
　　 結(jié)論：1、24小時(shí)首次半量換液培養(yǎng)有利于大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離和純化，培養(yǎng)細(xì)胞證實(shí)為

5、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。2、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外可定向誘導(dǎo)分化為內(nèi)耳毛細(xì)胞樣細(xì)胞。
　　 第二部分 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞內(nèi)耳移植治療藥物性聾
　　 目的：1.探討用于干細(xì)胞替代治療研究的感音神經(jīng)性聾動(dòng)物模型的建立方法；2.觀察骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植對(duì)正常耳蝸的影響；3.研究骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植到藥物性聾耳蝸內(nèi)的存活和分化情況。
　　 方法：1、應(yīng)用不同劑量阿米卡星連續(xù)1周，通過(guò)聽(tīng)覺(jué)腦干反應(yīng)閾值、耳蝸常規(guī)切片和掃描電鏡觀察，確

6、定適合用于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植的感音神經(jīng)性聾大鼠動(dòng)物模型。2、經(jīng)鼓階途徑將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植到正常聽(tīng)力大鼠耳蝸內(nèi)，通過(guò)聽(tīng)覺(jué)腦干反應(yīng)閾值、耳蝸常規(guī)切片觀察骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植對(duì)耳蝸結(jié)構(gòu)和功能的影響。3、經(jīng)鼓階途徑將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植到藥物性聾大鼠耳蝸內(nèi)，通過(guò)聽(tīng)覺(jué)腦干反應(yīng)閾值、免疫組化和掃描電鏡觀察植入細(xì)胞對(duì)感音神經(jīng)性聾聽(tīng)功能的影響及植入細(xì)胞在耳蝸內(nèi)的分化情況。
　　 結(jié)果：1、應(yīng)用阿米卡星按500mg·kg-1·d-1進(jìn)行連續(xù)

7、一周皮下注射，可造成大鼠聽(tīng)覺(jué)永久性閾移，3周后觀察柯替器毛細(xì)胞缺失，支持細(xì)胞損傷，呈現(xiàn)立方上皮樣結(jié)構(gòu)。2、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞鼓階導(dǎo)入對(duì)正常大鼠聽(tīng)功能和耳蝸結(jié)構(gòu)無(wú)明顯影響，可在鼓階和前庭階內(nèi)貼壁或游離存活至少4周。3、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植到藥物性聾動(dòng)物耳蝸內(nèi)可遷移到耳蝸基底膜處并具有聽(tīng)毛細(xì)胞特征，移植后8周聽(tīng)功能大多無(wú)明顯改善。
　　 結(jié)論：1、應(yīng)用阿米卡星可以建立起適合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞替代治療的理想動(dòng)物模型。2、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移