骨髓間充質干細胞應用于骨組織缺損修復的研究.pdf

1、骨髓間充質干細胞應用于骨組織缺損修復的研究博士后薄斌合作導師范明王常勇軍事醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所100850摘要由于腫瘤、外傷和骨骼異常等原因引起的大段骨缺損往往需要骨的重建。組織工程化骨組織的研究為骨缺損修復開辟了新的途經(jīng)。本研究應用組織工程方法對骨組織缺損修復再造進行了系列探討。研究內容包括(骨髓間充質干細胞)MSCs的生物學特性與成骨誘導分化、MSCs復合β-TCP體外成骨潛能以及MSCs復合β-TCP用于骨組織缺損修復等幾個方

2、面。 1.人骨髓間充質干細胞體外培養(yǎng)的生物學特征目的：了解體外培養(yǎng)的人骨髓MSCs一般細胞生物學特性。方法：抽取人骨髓標本5ml，采用比重為1.073g/ml的Percoll梯度離心制備單個有核細胞。按5.0×105/ml濃度接種于無菌的25cm2塑料培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)體系為含10％FBS的低糖DMEM。利用多孔培養(yǎng)板采用MTT法分別對培養(yǎng)的MSCs進行細胞生長曲線測定。通過流式細胞儀技術測定MSCs的細胞周期，并選用抗CD29、C

3、D44、CD45和HLA-DR單克隆抗體，對培養(yǎng)的MSCs進行表型鑒定。結果：培養(yǎng)的MSCs為紡錘狀，呈克隆樣生長。原代培養(yǎng)的MSCs克隆數(shù)目平均為43±11個。流式細胞儀檢測結果顯示，培養(yǎng)的各代細胞對CD44和CD29表面抗原有著較高水平的陽性表達率，而對于CD34和HLA-DR表面抗原的陽性表達率卻很低。G0/G1、S和G2/M期細胞的比例分別為88.17％、6.57％和5.27％。結論：培養(yǎng)的細胞不是骨髓造血干/祖細胞，而是一群均

4、一的間充質干細胞，具有獨特的增殖和表型特征。 2.體外培養(yǎng)人骨髓間充質干細胞成骨潛能的實驗研究目的：探討人骨髓MSCs體外培養(yǎng)、向成骨細胞分化的條件，為MSCs作為種子細胞應用于骨組織工程研究奠定基礎。方法：采用比重為1.073g/ml的Percoll細胞分離液從人骨髓中分離單個有核細胞進行MSCs培養(yǎng)，培養(yǎng)液為含10％胎牛血清的L-DMEM。應用流式細胞儀對培養(yǎng)的MSCs進行表型鑒定。在培養(yǎng)液中添加100nM地塞米松、10mM

5、β-甘油磷酸鈉和0.25mM抗壞血酸對培養(yǎng)第3代的MSCs進行成骨誘導培養(yǎng)。連續(xù)觀察MSCs向成骨細胞轉化過程中的形態(tài)學變化，在一定時間間隔通過堿性磷酸酶染色、Ⅰ型膠原免疫組織化學染色以及VonKossa染色方法對誘導培養(yǎng)的MSCs進行細胞生物學特性研究。應用X線衍射儀對誘導培養(yǎng)后形成的細胞外礦化基質進行物質成分分析。應用RT-PCR檢測誘導分化后的細胞骨鈣素mRNA的表達。對照組選擇未添加誘導液培養(yǎng)的MSCs進行上述各項指標的檢測。結

6、果：采用Percoll從人骨髓中分離培養(yǎng)的細胞符合MSCs表型特征，具有較高的純度。經(jīng)誘導培養(yǎng)的MSCs隨著時間的延長，多角型細胞逐漸增多并聚集成團，同時在細胞周圍出現(xiàn)點片狀鈣化斑，最終形成廣泛均一的礦化結節(jié)樣結構。免疫組化和組織化學染色顯示經(jīng)過誘導處理的MSCs表現(xiàn)為Ⅰ型膠原陽性、ALP陽性和細胞外鈣沉積，而未經(jīng)誘導的MSCs均為陰性。x線衍射分析證明，細胞外礦化基質為羥基磷灰石，它是構成無機骨質的重要成分。RT-PCR檢測表明誘導分

7、化后的細胞表達骨鈣素mRNA。結論：人骨髓MSCs可以在體外定向分化為成骨細胞，并具備成骨細胞的表型和功能，從而建立了一種新型的體外培養(yǎng)成骨細胞的生物學模型。 3.骨髓間充質干細胞在β-磷酸三鈣陶瓷內生長和成骨潛能的研究目的：明確在實驗室條件下培養(yǎng)體系中MSCs細胞在β-TCP三維結構中附著、增生和分化的生物學特點以及形成骨組織的可能性。方法：用比重為1.073g/ml的Percoll梯度離心人新鮮骨髓，收集單個有核細胞進行MS

8、Cs培養(yǎng)。將培養(yǎng)的MSCs制備成3×106/ml的細胞懸液，在96孔培養(yǎng)板中每孔取200μl與β-TCP復合。在培養(yǎng)液中添加100nM地塞米松、10mMβ-甘油磷酸鈉和0.25mM抗壞血酸對MSCs進行成骨誘導培養(yǎng)。分別于第1、7、14、21天每次取3孔在酶聯(lián)免疫檢測儀上進行MTT比色試驗，繪制MSCs在材料中的細胞生長曲線。分別于第5、10、15、20天對復合培養(yǎng)的上清液進行堿性磷酸酶含量測定。應用掃描電鏡觀察MSCs在材料中的生長情

9、況，并對復合物表面的細胞外基質成分采用x線能譜衍射法進行元素成分分析。將培養(yǎng)一定時間的復合物制備成組織切片標本，進行HE染色觀察。結果：掃描電鏡和生長曲線觀察表明MSCs在β-TCP材料中生長良好。復合物在有誘導劑存在的培養(yǎng)體系中有較高的堿性磷酸酶活性表達，并隨培養(yǎng)時間延長而增加，與非誘導培養(yǎng)體系比較，具有顯著性差異(P＜0.01)。培養(yǎng)30天的復合體組織切片中可以顯示類骨質的產(chǎn)生以及成骨細胞被包埋在新形成的骨基質中。x線能譜衍射分析顯

10、示細胞外基質中的結晶物質主要由鈣、磷元素構成。結論：所建立的MSCs-β-TCP培養(yǎng)體系中有三維骨組織形成，為利用MSCs和β-TCP進行組織工程化骨組織的體外構建以及進一步體內植入研究提供了相關的實驗依據(jù)。 4.骨髓間充質干細胞復合-多孔磷酸鈣陶瓷修復顱骨缺損的實驗研究目的：探索以MSCs作為種子細胞、β-TCP作為支架材料來構建組織工程化人工骨修復兔實驗性顱骨標準缺損的可行性。方法：實驗分三組。A組(n=12)：分離培養(yǎng)兔同

11、胎異體骨髓間充質干細胞，體外擴增后接種到預制的滅菌處理的β-磷酸三鈣(β-TCP)多孔生物陶瓷材料上，細胞-材料復合體經(jīng)體外孵育后，在無菌條件下植入同胎兔實驗性顱骨標準缺損處；B組(n=12)：采用單純β-TCP材料修復兔實驗性顱骨標準缺損；C組(n=4)：兔實驗性顱骨標準缺損區(qū)未做任何修復。術后4周和16周分別取材，進行缺損區(qū)組織化學分析。結果：A組顱骨缺損處表面肉眼可見骨樣組織形成，組織學觀察提示，術后4周時材料部分降解，未降解吸收

12、的材料孔洞內廣泛分布著新生骨組織，且成骨細胞外基質豐富。術后16周，支架材料幾乎完全降解，缺損區(qū)被新生骨組織所替代。B組術后4周，可見從缺損區(qū)邊緣有新生骨組織向支架材料內長入，支架材料部分吸收。至術后16周，可見從缺損區(qū)邊緣長入到支架材料內的新生骨組織逐漸增多，但材料的中心部位未發(fā)現(xiàn)新生骨形成。C組術后16周，僅見少量骨組織從缺損區(qū)邊緣向缺損區(qū)內長入，缺損中央大部分區(qū)域仍未得到修復。結論：體外培養(yǎng)擴增的兔MSCs在不添加外源性生長因子的

13、情況下，與TCP復合植入后可以在體內誘導、分化為成骨細胞并能夠對標準的顱骨缺損進行有效的修復，可以進一步推廣到臨床應用。 綜合上述實驗，分離培養(yǎng)的MSCs純度高、形態(tài)和表型均一，可以在體外定向分化為成骨細胞，因此，有條件成為骨組織工程應用的種子細胞。MSCs在多孔磷酸鈣陶瓷內生長及其成骨潛能為MSCs復合β-TCP構建組織工程骨用于骨組織缺損研究提供了生物學基礎。MSCs復合β-TCP對兔顱骨缺損的有效修復為臨床應用奠定了實驗基