骨髓間充質(zhì)干細胞應(yīng)用于骨組織缺損修復(fù)的研究.pdf

1、骨髓間充質(zhì)干細胞應(yīng)用于骨組織缺損修復(fù)的研究博士后薄斌合作導(dǎo)師范明王常勇軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所100850摘要由于腫瘤、外傷和骨骼異常等原因引起的大段骨缺損往往需要骨的重建。組織工程化骨組織的研究為骨缺損修復(fù)開辟了新的途經(jīng)。本研究應(yīng)用組織工程方法對骨組織缺損修復(fù)再造進行了系列探討。研究內(nèi)容包括(骨髓間充質(zhì)干細胞)MSCs的生物學(xué)特性與成骨誘導(dǎo)分化、MSCs復(fù)合β-TCP體外成骨潛能以及MSCs復(fù)合β-TCP用于骨組織缺損修復(fù)等幾個方

2、面。 1.人骨髓間充質(zhì)干細胞體外培養(yǎng)的生物學(xué)特征目的：了解體外培養(yǎng)的人骨髓MSCs一般細胞生物學(xué)特性。方法：抽取人骨髓標(biāo)本5ml，采用比重為1.073g/ml的Percoll梯度離心制備單個有核細胞。按5.0×105/ml濃度接種于無菌的25cm2塑料培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)體系為含10％FBS的低糖DMEM。利用多孔培養(yǎng)板采用MTT法分別對培養(yǎng)的MSCs進行細胞生長曲線測定。通過流式細胞儀技術(shù)測定MSCs的細胞周期，并選用抗CD29、C

3、D44、CD45和HLA-DR單克隆抗體，對培養(yǎng)的MSCs進行表型鑒定。結(jié)果：培養(yǎng)的MSCs為紡錘狀，呈克隆樣生長。原代培養(yǎng)的MSCs克隆數(shù)目平均為43±11個。流式細胞儀檢測結(jié)果顯示，培養(yǎng)的各代細胞對CD44和CD29表面抗原有著較高水平的陽性表達率，而對于CD34和HLA-DR表面抗原的陽性表達率卻很低。G0/G1、S和G2/M期細胞的比例分別為88.17％、6.57％和5.27％。結(jié)論：培養(yǎng)的細胞不是骨髓造血干/祖細胞，而是一群均

4、一的間充質(zhì)干細胞，具有獨特的增殖和表型特征。 2.體外培養(yǎng)人骨髓間充質(zhì)干細胞成骨潛能的實驗研究目的：探討人骨髓MSCs體外培養(yǎng)、向成骨細胞分化的條件，為MSCs作為種子細胞應(yīng)用于骨組織工程研究奠定基礎(chǔ)。方法：采用比重為1.073g/ml的Percoll細胞分離液從人骨髓中分離單個有核細胞進行MSCs培養(yǎng)，培養(yǎng)液為含10％胎牛血清的L-DMEM。應(yīng)用流式細胞儀對培養(yǎng)的MSCs進行表型鑒定。在培養(yǎng)液中添加100nM地塞米松、10mM

5、β-甘油磷酸鈉和0.25mM抗壞血酸對培養(yǎng)第3代的MSCs進行成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)。連續(xù)觀察MSCs向成骨細胞轉(zhuǎn)化過程中的形態(tài)學(xué)變化，在一定時間間隔通過堿性磷酸酶染色、Ⅰ型膠原免疫組織化學(xué)染色以及VonKossa染色方法對誘導(dǎo)培養(yǎng)的MSCs進行細胞生物學(xué)特性研究。應(yīng)用X線衍射儀對誘導(dǎo)培養(yǎng)后形成的細胞外礦化基質(zhì)進行物質(zhì)成分分析。應(yīng)用RT-PCR檢測誘導(dǎo)分化后的細胞骨鈣素mRNA的表達。對照組選擇未添加誘導(dǎo)液培養(yǎng)的MSCs進行上述各項指標(biāo)的檢測。結(jié)

6、果：采用Percoll從人骨髓中分離培養(yǎng)的細胞符合MSCs表型特征，具有較高的純度。經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)的MSCs隨著時間的延長，多角型細胞逐漸增多并聚集成團，同時在細胞周圍出現(xiàn)點片狀鈣化斑，最終形成廣泛均一的礦化結(jié)節(jié)樣結(jié)構(gòu)。免疫組化和組織化學(xué)染色顯示經(jīng)過誘導(dǎo)處理的MSCs表現(xiàn)為Ⅰ型膠原陽性、ALP陽性和細胞外鈣沉積，而未經(jīng)誘導(dǎo)的MSCs均為陰性。x線衍射分析證明，細胞外礦化基質(zhì)為羥基磷灰石，它是構(gòu)成無機骨質(zhì)的重要成分。RT-PCR檢測表明誘導(dǎo)分

7、化后的細胞表達骨鈣素mRNA。結(jié)論：人骨髓MSCs可以在體外定向分化為成骨細胞，并具備成骨細胞的表型和功能，從而建立了一種新型的體外培養(yǎng)成骨細胞的生物學(xué)模型。 3.骨髓間充質(zhì)干細胞在β-磷酸三鈣陶瓷內(nèi)生長和成骨潛能的研究目的：明確在實驗室條件下培養(yǎng)體系中MSCs細胞在β-TCP三維結(jié)構(gòu)中附著、增生和分化的生物學(xué)特點以及形成骨組織的可能性。方法：用比重為1.073g/ml的Percoll梯度離心人新鮮骨髓，收集單個有核細胞進行MS

8、Cs培養(yǎng)。將培養(yǎng)的MSCs制備成3×106/ml的細胞懸液，在96孔培養(yǎng)板中每孔取200μl與β-TCP復(fù)合。在培養(yǎng)液中添加100nM地塞米松、10mMβ-甘油磷酸鈉和0.25mM抗壞血酸對MSCs進行成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)。分別于第1、7、14、21天每次取3孔在酶聯(lián)免疫檢測儀上進行MTT比色試驗，繪制MSCs在材料中的細胞生長曲線。分別于第5、10、15、20天對復(fù)合培養(yǎng)的上清液進行堿性磷酸酶含量測定。應(yīng)用掃描電鏡觀察MSCs在材料中的生長情

9、況，并對復(fù)合物表面的細胞外基質(zhì)成分采用x線能譜衍射法進行元素成分分析。將培養(yǎng)一定時間的復(fù)合物制備成組織切片標(biāo)本，進行HE染色觀察。結(jié)果：掃描電鏡和生長曲線觀察表明MSCs在β-TCP材料中生長良好。復(fù)合物在有誘導(dǎo)劑存在的培養(yǎng)體系中有較高的堿性磷酸酶活性表達，并隨培養(yǎng)時間延長而增加，與非誘導(dǎo)培養(yǎng)體系比較，具有顯著性差異(P＜0.01)。培養(yǎng)30天的復(fù)合體組織切片中可以顯示類骨質(zhì)的產(chǎn)生以及成骨細胞被包埋在新形成的骨基質(zhì)中。x線能譜衍射分析顯

10、示細胞外基質(zhì)中的結(jié)晶物質(zhì)主要由鈣、磷元素構(gòu)成。結(jié)論：所建立的MSCs-β-TCP培養(yǎng)體系中有三維骨組織形成，為利用MSCs和β-TCP進行組織工程化骨組織的體外構(gòu)建以及進一步體內(nèi)植入研究提供了相關(guān)的實驗依據(jù)。 4.骨髓間充質(zhì)干細胞復(fù)合-多孔磷酸鈣陶瓷修復(fù)顱骨缺損的實驗研究目的：探索以MSCs作為種子細胞、β-TCP作為支架材料來構(gòu)建組織工程化人工骨修復(fù)兔實驗性顱骨標(biāo)準(zhǔn)缺損的可行性。方法：實驗分三組。A組(n=12)：分離培養(yǎng)兔同

11、胎異體骨髓間充質(zhì)干細胞，體外擴增后接種到預(yù)制的滅菌處理的β-磷酸三鈣(β-TCP)多孔生物陶瓷材料上，細胞-材料復(fù)合體經(jīng)體外孵育后，在無菌條件下植入同胎兔實驗性顱骨標(biāo)準(zhǔn)缺損處；B組(n=12)：采用單純β-TCP材料修復(fù)兔實驗性顱骨標(biāo)準(zhǔn)缺損；C組(n=4)：兔實驗性顱骨標(biāo)準(zhǔn)缺損區(qū)未做任何修復(fù)。術(shù)后4周和16周分別取材，進行缺損區(qū)組織化學(xué)分析。結(jié)果：A組顱骨缺損處表面肉眼可見骨樣組織形成，組織學(xué)觀察提示，術(shù)后4周時材料部分降解，未降解吸收

12、的材料孔洞內(nèi)廣泛分布著新生骨組織，且成骨細胞外基質(zhì)豐富。術(shù)后16周，支架材料幾乎完全降解，缺損區(qū)被新生骨組織所替代。B組術(shù)后4周，可見從缺損區(qū)邊緣有新生骨組織向支架材料內(nèi)長入，支架材料部分吸收。至術(shù)后16周，可見從缺損區(qū)邊緣長入到支架材料內(nèi)的新生骨組織逐漸增多，但材料的中心部位未發(fā)現(xiàn)新生骨形成。C組術(shù)后16周，僅見少量骨組織從缺損區(qū)邊緣向缺損區(qū)內(nèi)長入，缺損中央大部分區(qū)域仍未得到修復(fù)。結(jié)論：體外培養(yǎng)擴增的兔MSCs在不添加外源性生長因子的

13、情況下，與TCP復(fù)合植入后可以在體內(nèi)誘導(dǎo)、分化為成骨細胞并能夠?qū)?biāo)準(zhǔn)的顱骨缺損進行有效的修復(fù)，可以進一步推廣到臨床應(yīng)用。 綜合上述實驗，分離培養(yǎng)的MSCs純度高、形態(tài)和表型均一，可以在體外定向分化為成骨細胞，因此，有條件成為骨組織工程應(yīng)用的種子細胞。MSCs在多孔磷酸鈣陶瓷內(nèi)生長及其成骨潛能為MSCs復(fù)合β-TCP構(gòu)建組織工程骨用于骨組織缺損研究提供了生物學(xué)基礎(chǔ)。MSCs復(fù)合β-TCP對兔顱骨缺損的有效修復(fù)為臨床應(yīng)用奠定了實驗基