G6PD缺乏癥胚胎植入前遺傳學(xué)診斷體系的建立.pdf

1、研究背景:
　　植入前遺傳學(xué)診斷（preimplantation genetic diagnosis,PGD）是在胚胎植入子宮前進(jìn)行的最早期的產(chǎn)前遺傳學(xué)診斷，是杜絕致病基因垂直傳播的最有效方法。葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（glucose-6-phosphate dehydrogenase,G6PD）缺乏癥，是世界上最常見的酶缺陷病之一，為X連鎖不完全顯性遺傳。臨床表現(xiàn)具有高度異質(zhì)性，主要表現(xiàn)為溶血性貧血和以未結(jié)合膽紅素升高為特點(diǎn)的高膽

2、紅素血癥。成年患者最嚴(yán)重的威脅是出現(xiàn)急性腎衰竭，而新生兒期發(fā)病則可導(dǎo)致核黃疸，造成永久性神經(jīng)系統(tǒng)損傷甚至死亡。該病是聯(lián)合國衛(wèi)生組織6種主要應(yīng)該預(yù)防和控制的遺傳病之一，亦是廣東省及深圳市出生缺陷干預(yù)工程的干預(yù)病種之一。目前國內(nèi)外主要通過性別選擇避免有表型的胚胎移植，尚無針對(duì)G6PD基因PGD的報(bào)道。簡單的性別選擇并不適用于所有G6PD缺乏癥夫婦，只有通過針對(duì)性的G6PD基因的檢測才能最有效地阻斷該基因的垂直傳播，達(dá)到優(yōu)生目的。故建立G6P

3、D基因PGD診斷意義深遠(yuǎn)。
　　研究目的:
　?。?）應(yīng)用巢式PCR聯(lián)合多重SNaPshot技術(shù)，建立穩(wěn)定、快速、準(zhǔn)確的單細(xì)胞G6PD基因診斷方法，并評(píng)估巢式PCR法在G6PD缺乏癥PGD中的可行性。
　?。?）應(yīng)用全基因組擴(kuò)增（whole genome amplification,WGA）技術(shù)，聯(lián)合多重SNaPshot微測序和單倍型分析，建立可監(jiān)測污染和等位基因脫扣（allele drop out，ADO）發(fā)生與否的

4、單細(xì)胞G6PD基因診斷體系，并評(píng)估該體系在G6PD缺乏癥PGD中的可行性。
　　研究方法:
　?。?）獲取單淋巴細(xì)胞，應(yīng)用巢式PCR結(jié)合多重SNaPshot技術(shù)建立對(duì)G6PD基因突變高發(fā)的Exo n2、9、11、12四個(gè)外顯子上的12個(gè)突變位點(diǎn)的單細(xì)胞基因診斷方法。
　?。?）分別獲取單淋細(xì)胞、單卵裂球及滋養(yǎng)層細(xì)胞，在 WGA技術(shù)基礎(chǔ)上應(yīng)用多重SNaPshot技術(shù)檢測25個(gè)已報(bào)道的中國人群G6PD基因突變位點(diǎn)，并聯(lián)合X

5、q28上6個(gè)短串聯(lián)重復(fù)序列（short tandem repeat，STR）位點(diǎn)的單倍型分析技術(shù)及Amelogenin基因的性別診斷技術(shù)建立G6PD缺乏癥PGD診斷體系。
　　研究結(jié)果:
　?。?）應(yīng)用多重巢式PCR結(jié)合SNaPshot技術(shù)在單細(xì)胞水平上成功建立檢測Exon2、Exon9、Exon11、Exon12上12個(gè)G6PD突變位點(diǎn)的基因診斷方法，檢測58個(gè)正常和108個(gè)雜合子單淋巴細(xì)胞，擴(kuò)增效率為90.97％，ADO

6、率為8.08%。
　?。?）聯(lián)合應(yīng)用WGA技術(shù)、SNaPshot基因分型技術(shù)、單倍型分析技術(shù)和性別診斷技術(shù)，在單細(xì)胞水平上成功建立既可擴(kuò)增所有能發(fā)生突變的外顯子，檢測25個(gè)已報(bào)道的中國人群G6PD基因突變位點(diǎn)，又能同時(shí)監(jiān)測污染或ADO的診斷體系。檢測60個(gè)正常和96個(gè)雜合子單淋巴細(xì)胞，WGA擴(kuò)增效率為94.23%；成功擴(kuò)增的 WGA產(chǎn)物在后續(xù)基因檢測的總擴(kuò)增效率為89.37%，總的 ADO率為13.74%，各項(xiàng)基因間的擴(kuò)增效率和A

7、DO率有統(tǒng)計(jì)差異（P<0.05）。檢測24個(gè)單卵裂球，WGA擴(kuò)增效率為95.83%；成功擴(kuò)增WGA產(chǎn)物在后續(xù)基因檢測的總擴(kuò)增效率為92.39%，總的ADO率為10.00%，各項(xiàng)基因間的擴(kuò)增效率無統(tǒng)計(jì)差異（P>0.05）?；顧z8個(gè)囊胚的滋養(yǎng)層細(xì)胞，WGA均擴(kuò)增成功，后續(xù)實(shí)驗(yàn)中亦未見基因擴(kuò)增失敗，滋養(yǎng)層細(xì)胞的檢測結(jié)果均與對(duì)應(yīng)的囊胚陽性對(duì)照一致，未見ADO發(fā)生。
　?。?）比較所建立的兩種方法對(duì)單淋巴細(xì)胞的檢測效果，巢式PCR法的擴(kuò)增效

8、率更高（90.97%v s.78.21%，P=0.001），ADO率更低（8.08%v s.19.48%，P=0.026），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。WGA法可擴(kuò)增檢測更多的外顯子和突變位點(diǎn)，并可在G6PD基因分型的同時(shí)，監(jiān)測是否存在污染或ADO的可能性，診斷結(jié)果更為準(zhǔn)確可靠。
　　結(jié)論:
　?。?）所建立的多重巢式PCR結(jié)合SNaPshot技術(shù)具有擴(kuò)增效率高、ADO率低、時(shí)效性好和成本低等優(yōu)點(diǎn)，可在單細(xì)胞水平上快速、準(zhǔn)確地檢測1

9、2個(gè)G6PD基因突變位點(diǎn)。
　?。?）在單細(xì)胞水平上聯(lián)合應(yīng)用WGA技術(shù)、SNaPshot基因分型技術(shù)、性別診斷技術(shù)和單倍型分析技術(shù)所建立的G6PD基因診斷體系，適用于25個(gè)G6PD基因突變位點(diǎn)的PGD。雖然擴(kuò)增效率較低和ADO率較高，但可通過單倍型分析的結(jié)果來提示是否存在污染或ADO的可能性，從最大程度上保證診斷結(jié)果的可靠性，減少PGD的誤診率。
　　（3）通過進(jìn)行囊胚期胚胎的滋養(yǎng)層細(xì)胞活檢，獲得多個(gè)細(xì)胞進(jìn)行PGD，可有效彌