通心絡對β-淀粉樣蛋白腦室注射所致阿爾茨海默病模型大鼠干預作用研究.pdf

1、目的:采用β-淀粉樣蛋白(amyloid-beta protein,Ap)腦室注射方法建立阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)大鼠模型,并用通心絡進行干預,通過觀察大鼠學習記憶能力、血清和腦組織勻漿中氧化應激、腦組織勻漿膽堿能相關指標、免疫組化檢測海馬β-淀粉樣前體蛋白(β-amyloid precursor protein,APP)表達、剛果紅染色檢測海馬Aβ表達、Westerblot檢測海馬tau蛋白表達的改

2、變,為通心絡臨床治療AD提供實驗依據(jù)。
　　 方法:
　　 實驗一通心絡對Aβ所致AD模型大鼠學習記憶功能的影響
　　 健康雄性SD大鼠70只,體重250～300g,隨機分為7組:(1)正常組；(2)假手術組；(3)模型組；(4)通心絡小劑量組(0.6g生藥/kg.d)；(5)通心絡中劑量組(1.2g生藥/kg.d)；(6)通心絡大劑量組(2.4g生藥/kg.d)；(7)金納多組(0.032g生藥/kg.d)。用

3、側腦室注射Aβ的方法建立AD大鼠模型,假手術組注射等量生理鹽水,手術3天后進行藥物干預,正常組、假手術組、模型組給予相同劑量的生理鹽水。給藥21天后,采用Morris水迷宮檢測各組大鼠的平均逃避潛伏期時間和游泳總路程,共6d。
　　 實驗二通心絡對Aβ所致AD模型大鼠氧化應激的影響
　　 實驗動物分組及給藥同實驗一,給藥30天后,大鼠頸總動脈取血,分離血清,斷頭取腦,切取海馬部位勻漿離心,黃嘌呤氧化酶法檢測SOD的含量,

4、硫代巴比妥酸(TBA)比色分析法檢測MDA含量,化學比色法檢測GSH-Px活性。
　　 實驗三通心絡對Aβ所致AD模型大鼠膽堿能系統(tǒng)功能的影響
　　 實驗動物分組及給藥同實驗一,給藥30天后,大鼠斷頭取腦,切取海馬部位勻漿離心,用硫代丁酰膽堿比色法檢測ChE酶活性,比色法檢測AchE酶活性。
　　 實驗四通心絡對Aβ所致AD模型大鼠海馬APP、Aβ表達的影響
　　 實驗分組及給藥方法同實驗一。給藥30天后

5、,大鼠心臟灌注取腦,4％多聚甲醛固定,常規(guī)梯度酒精脫水,二甲苯透明后,浸蠟,石蠟包埋,皮質(zhì)和海馬連續(xù)切片,免疫組化檢測海馬APP的表達。切片脫蠟至水,甲醇剛果紅染液染色,用堿性乙醇分化液分化,水洗,蘇木素復染,脫水,透明,封固,檢測大腦海馬Aβ的表達。
　　 實驗五通心絡對Ap所致AD模型大鼠海馬磷酸化Tau蛋白的影響
　　 實驗分組及給藥方法同實驗一。給藥30天后,斷頭取腦,快速切下海馬,研磨后進行蛋白定量,Weste

6、rnblot檢測各組大鼠海馬Tau蛋白表達的改變。
　　 結果:
　　 1各組大鼠水迷宮行為學的改變結果顯示
　　 1.1潛伏期(s):實驗期間,與正常組比較,模型組逃避潛伏期時間明顯延長,有統(tǒng)計學意義(P<0.01),而假手術組和正常組相比無顯著性差異(P>0.05)。實驗第1d,各用藥組與模型組相比無顯著性差異(P>0.05)；第2d通心絡大、小劑量組、金納多組與模型組相比潛伏期明顯縮短,且有統(tǒng)計學意義(P<

7、0.05,P<0.01)；第3-6d,各用藥組潛伏期與模型組相比均有統(tǒng)計學意義(P<0.05,P<0.01)。
　　 1.2總路程(cm):實驗期間,與正常組比較,模型組游泳總路程明顯延長,有統(tǒng)計學意義(P<0.01),而假手術組和正常組相比無顯著性差異(P>0.05)。第1d,各用藥組與模型組相比無顯著性差異(P>0.05)；從第2d開始,金納多組與模型組相比總路程明顯縮短(P<0.01)；第3d,通心絡中劑量組,金納多組與模

8、型組相比總路程明顯縮短(P<0.05)；第4、5d通心絡大、中、小劑量組,與模型組相比總路程縮短有統(tǒng)計學差異(P<0.05,P<0.01),第6d,各用藥組總路程均縮短,其中通心絡中、小劑量組、金納多組與模型組相比有統(tǒng)計學意義(P<0.05,P<0.01)。
　　 2.各組大鼠SOD、GSH-Px、MDA活性的改變結果顯示
　　 2.1各組大鼠腦組織勻漿SOD、GSH-Px、MDA活性的改變結果顯示與正常組相比,模型組S

9、OD、GSH-Px活性顯著降低,MDA含量顯著升高,均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；各指標假手術組與正常組相比均無顯著性差異(P>0.05)；與模型組相比,各用藥組SOD活性均明顯升高,MDA含量均顯著降低,有統(tǒng)計學意義(P<0.05,P<0.01)；GSFt-Px活性,與模型組相比,通心絡大、中劑量組活性均明顯增高,有統(tǒng)計學意義(P<0.01),而通心絡小劑量組、金納多組與模型組相比無顯著性差異(P>0.05)。
　　 2.2

10、各組大鼠血清中SOD、GSH—Px、MDA活性的改變結果顯示與正常組相比,模型組SOD活性、GSH-Px活性顯著降低,MDA含量顯著升高,均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；各指標假手術組與正常組相比均無顯著性差異(P>0.05)；與模型組相比,各用藥組SOD活性均明顯增高,MDA含量均顯著降低,有統(tǒng)計學意義(P<0.05,P<0.01)；而GSH-Px活性,僅見通心絡大劑量組明顯增高,有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。
　　 3.各組

11、大鼠ChE、AchE酶活性的改變結果顯示與正常組相比,模型組ChE、AchE酶活性顯著升高,有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；而假手術組與正常組相比無顯著性差異(P>0.05)；與模型組相比,各用藥組ChE、AchE酶活性均明顯降低,有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。
　　 4.各組大鼠海馬區(qū).APP、Ap表達的改變
　　 4.1各組大鼠海馬區(qū)APP表達的改變結果顯示正常組:APP少量陽性細胞,且染色較弱,表達量較低,海馬區(qū)與大

12、鼠大腦皮質(zhì)部分均有少量分布。假手術組:APP少量陽性細胞,且染色較弱,表達量較低,海馬區(qū)與大鼠大腦皮質(zhì)部分均有少量分布。模型組:APP陽性細胞大量表達,且多呈強陽性染色,廣泛分布于海馬區(qū),大鼠大腦皮質(zhì)部分分布。通心絡大中小劑量組可見APP陽性細胞,染色較強,有一定表達,海馬區(qū)廣泛分布,大鼠大腦皮質(zhì)部分有少量分布。金納多組可見APP陽性細胞數(shù)目表達很多,多成強陽性染色,廣泛分布于海馬區(qū),大鼠大腦皮質(zhì)部分分布。
　　 4.2各組大鼠

13、海馬區(qū)Ap表達的改變結果顯示正常組:剛果紅染色陰性,尼氏小體豐富清晰。假手術組:剛果紅染色陰性,尼氏小體豐富清晰。模型組:剛果紅染色呈陽性反應,神經(jīng)元尼氏小體著色淡,結構紊亂不清晰。通心絡大劑量組:剛果紅染色呈陽性反應,神經(jīng)元尼氏小體著色淡。通心絡中劑量組:剛果紅染色呈陽性反應,神經(jīng)元尼氏小體著色淡。通心絡小劑量組:剛果紅染色呈陽性反應,神經(jīng)元尼氏小體著色淡。金納多組:染色呈陽性反應,神經(jīng)元尼氏小體著色淡,結構紊亂不清晰。
　　

14、 5.各組大鼠海馬區(qū)磷酸化Tau蛋白表達的改變結果顯示與正常組相比,模型組磷酸化Tau蛋白OD值明顯升高,且有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；而假手術組與正常組相比無顯著性差異(P>0.05)；與模型組相比,各用藥組磷酸化Tau蛋白OD值明顯降低,有統(tǒng)計學意義(P<0.05,P<0.01)。
　　 結論:
　　 1.絡病學說是中醫(yī)理論特色組成部分
　　 元氣虧虛而致的脈絡瘀阻是癡呆發(fā)病及加重的關鍵因素及重要病理環(huán)節(jié),

15、氣血津液運行失常,體內(nèi)生理或病理產(chǎn)物不能及時排除,蓄積體內(nèi),生成瘀血,瘀血阻滯脈絡,脈絡“血主濡之”功能失常,即脈絡在末端發(fā)生的供血供氣、津血互換、營養(yǎng)代謝三大功能活動功能失常,不能為氣絡功能活動提供物質(zhì)基礎,氣絡失去血液及其他營養(yǎng)物質(zhì)的濡養(yǎng),就會更加加重氣絡損傷,溫煦調(diào)養(yǎng)和信息傳達功能失常,而出現(xiàn)癡呆證候。
　　 2.通心絡可以顯著改善Aβ腦室注射所致AD模型大鼠學習記憶功能的障礙,其作用可能是通過減輕體內(nèi)體內(nèi)自由基增多引起的