新城疫廣西-9的全長(zhǎng)測(cè)序及Muketeswar疫苗株的病毒拯救.pdf

1、在全球的家禽養(yǎng)殖業(yè)中,新城疫已經(jīng)成為巨大的威脅疫病,1926年首次暴發(fā),至今已造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失,已經(jīng)被國(guó)際獸醫(yī)局列為A類傳染病。在全世界范圍內(nèi)已經(jīng)引起了廣泛的關(guān)注。我國(guó)關(guān)于新城疫的報(bào)道最早造見于河南,時(shí)間為1935年。新城疫暴發(fā)的始作俑者為病毒NDV,目前,國(guó)際上通用的毒力測(cè)試指標(biāo)為MDT、ICPI和IVPI,依據(jù)這三個(gè)指標(biāo)的綜合分析,我們可以將NDV分為強(qiáng)毒株、中毒株和弱毒株。NDV屬于負(fù)鏈的不分節(jié)段的RNA病毒,歸屬在副粘病毒科

2、的禽副粘病毒屬。全長(zhǎng)基因編碼6個(gè)功能蛋白,分別為NP、P、M、F、HN和L。其中,與細(xì)胞的融合和毒力相關(guān)的主要蛋白是F和HN,也是研究最多的蛋白。
　　反向遺傳學(xué)目前已經(jīng)廣泛運(yùn)用到NDV的分子研究中了,早在1999年就已經(jīng)報(bào)道了NDV病毒的拯救成功案例。實(shí)驗(yàn)研究的是低毒力的LaSota,期間是對(duì)P基因的剪接位點(diǎn)進(jìn)行了修飾。嵌合重組的NDV的產(chǎn)生也相繼被報(bào)道。病毒拯救成功的條件是:全長(zhǎng)cDNA的完整克隆、輔助質(zhì)粒NP、P和L的成功構(gòu)

3、建以及可以穩(wěn)定表達(dá)T7聚合酶的細(xì)胞體系。NDV的復(fù)制中,輔助質(zhì)粒的作用是不可或缺的,螺旋狀的核衣殼是RNA復(fù)制的主要模板,而核衣殼蛋白NP和基因組RNA共同構(gòu)成了核心結(jié)構(gòu),磷蛋白P和大蛋白L附著在核心結(jié)構(gòu)上,這樣共同組成了轉(zhuǎn)錄復(fù)制復(fù)合物,這也是復(fù)制的關(guān)鍵所在。
　　本實(shí)驗(yàn)中,為了研究廣西-9毒株是否與其他的毒株存在著重組情況,我們的工作就是為此做好基礎(chǔ),將此毒株的全長(zhǎng)進(jìn)行測(cè)序。由于其基因組太長(zhǎng),我們需要分段進(jìn)行測(cè)序,經(jīng)過(guò)RT-PC

4、R得到8條DNA序列,送往華大進(jìn)行測(cè)序,成功得到廣西-9的全長(zhǎng)序列。
　　實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)有Mukeswar的全長(zhǎng)cDNA克隆質(zhì)粒,它的起始位置添加了T7啟動(dòng)子序列,末端添加了丁肝核酶和T7終止子序列,還有可以表達(dá)T7聚合酶的輔助質(zhì)粒,本研究中,我們將NP、P克隆到真核表達(dá)質(zhì)粒pCDNA3.0上,L基因分段克隆到重新構(gòu)建的新的表達(dá)載體pMC18-CMV上。后將五種質(zhì)粒成功共轉(zhuǎn)染至BHK-21細(xì)胞中引起細(xì)胞病變,經(jīng)RT-PCR鑒定及序列比