拔毒生肌散的毒性特點及方中爐甘石對汞毒性的影響研究.pdf

1、應(yīng)用紅粉、輕粉、朱砂等含汞成分中藥及其制劑治療慢性難愈性皮膚潰瘍是中醫(yī)外科的特色之一。但因其含有汞、鉛等重金屬成分，加之沒有明確的使用劑量和周期，存在較大的安全性隱患，使該類傳統(tǒng)外用制劑的臨床應(yīng)用和推廣受到了限制。本研究選擇來源于古代外科名方“生肌散”的拔毒生肌散（Badu Shengji San，BDSJS）為代表藥物，研究其毒性特點，以為臨床安全用藥提供基礎(chǔ)研究數(shù)據(jù)。目前，國內(nèi)對含汞外用制劑反復用藥后的毒性特點尚無報道。
　　

2、 國外最新研究發(fā)現(xiàn)ZnCl2對HgCl2引起的乳鼠腎損傷具有保護作用[1]。提示，鋅對汞誘發(fā)的腎損傷具有一定的保護作用。本課題前期研究已證明汞是BDSJS的主要毒性成分，腎臟是其主要毒性靶器官，且方中的配伍藥昧能夠減輕汞所致的腎損傷[2]。在配伍藥味中，爐甘石（煅）的主要成分是氧化鋅。由此我們在前期研究基礎(chǔ)上進行推論，認為以鋅為主要成分的爐甘石可能是BDSJS中汞成分的減毒藥味?；谝陨险J識，本研究以含汞成分的紅粉作為染毒藥物，觀察爐

3、甘石對破損皮膚大鼠腎損傷的影響，探討其對汞代謝方面的可能影響及其機制。目前，國內(nèi)對爐甘石及鋅降低汞毒性及其配伍減毒機制尚無報道。
　　 本論文包括兩個部分:BDSJS的毒性特點和方中爐甘石對汞毒性的影響。
　　 1 BDSJS的毒性特點研究
　　 1.1對破損皮膚大鼠反復給藥汞成分在體內(nèi)的蓄積情況研究
　　 目的：
　　 觀察BDSJS反復給藥后汞成分存大鼠體內(nèi)的蓄積情況，明確BDSJS的安全劑量

4、、用藥周期及毒性可逆程度。
　　 方法：
　　 采用破損皮膚大鼠模型，分別以高、中、低劑量的100、50、25mg/kg BDSJS涂敷于大鼠背部破損皮膚給藥區(qū)，敷藥后固定24h，每日給藥1次，連續(xù)給藥4周。檢測給藥4周、停藥4周及停藥8周大鼠血、尿、腎皮質(zhì)中的汞含量，觀察汞成分在破損皮膚大鼠體內(nèi)的蓄積情況，并以腎早期損傷指標尿視黃醇結(jié)合蛋白(RBP)、N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAG)和β2-微球蛋白（β2-M

5、G）含量、肝腎功能、凝血時間及腎組織形態(tài)學變化為腎毒性指標，評價汞蓄積是否可造成腎組織的損傷及其嚴重程度。
　　 結(jié)果：
　　 與破損皮膚對照組比較，用藥4周BDSJS高、中、低劑量組大鼠的血汞、尿汞、腎汞含量均明顯升高，且升高呈劑量依賴性;停藥4周，BDSJS各組大鼠的血汞含量均已恢復至正常水平，尿汞含量下降80-90％，腎汞含量下降50％以上;停藥8周，BDSJS各組大鼠尿汞均恢復至正常水平，腎汞下降70％以上，但仍

6、有一定蓄積。
　　 BDSJS高劑量組給藥4周，在腎汞含量為（47.99±15.66）ng/g，血汞含量為（72.06±18.03）ng/g，尿汞含量為（1278.84±711.82）ng/mL時，大鼠出現(xiàn)腎臟系數(shù)和β2-MG含量的明顯升高，腎組織病理檢查見少數(shù)大鼠出現(xiàn)腎小管上皮細胞腫脹;停藥4周，腎汞含量為（20.43±5.09）ng/g，尿汞含量為（82.70±25.83）ng/mL，血汞含量為（5.59±0.94）ng/m

7、L（基本恢復正常水平）時，腎臟系數(shù)、尿β2-MG及腎組織形態(tài)基本恢復正常;停藥8周，雖腎組織中汞仍有一定蓄積，含量為（18.60±12.35）ng/g，但尿β2-MG及腎組織形態(tài)恢復正常。中、低劑量組大鼠在給藥4周，血汞分別為（38.44±28.72）ng/g和(26.63±18.67)ng/g，尿汞分別為（380.80±119.32）ng/mL和(239.53±110.34)ng/mL，腎汞含量分別為(31.27±11.21)μg/g

8、和（11.93±3.12）μg/g，但腎臟系數(shù)及尿β2-MG未見明顯差異。
　　 結(jié)論：
　　 BDSJS連續(xù)外敷4周，可造成汞在破損皮膚大鼠血液及腎臟中的蓄積，主要蓄積在腎臟;血中汞的清除較快，停藥4周基本恢復到正常水平;停藥8周，BDSJS中、低劑量組大鼠尿汞恢復至正常水平，腎臟中汞的清除超過70％，但仍有一定蓄積;BDSJS高劑量100mg/kg可造成腎小管的輕度損傷，但其損傷是可逆的，停藥4周后可基本恢復，中劑量

9、50mg/kg為其安全劑量。
　　 1.2 BDSJS對慢性皮膚潰瘍患者汞成分在機體內(nèi)的蓄積情況研究
　　 目的
　　 采用動物安全性評價得出的安全劑量和用藥周期，觀察慢性下肢瘡瘍患者以BDSJS外敷治療4周及停藥后汞在體內(nèi)的蓄積情況，為制定臨床安全劑量和給藥周期提供依據(jù)。
　　 方法
　　 入組患者每日給藥1次，或視患者創(chuàng)面情況隔日換藥1次，以0.28mg/cm2/d的劑量治療4周，測定患者治療

10、前、治療4周、停藥2周及停藥6周的血汞及尿汞含量，并以血清ALT、AST、BUN、Cr、尿NAG及β2-MG為毒性觀察指標，評價汞蓄積對患者肝、腎功能指標的影響。
　　 結(jié)果
　　 外敷BDSJS治療慢性皮膚潰瘍，患者在用藥4周血汞含量為(8.10±14.81)ng/mL,尿汞含量為（11.51±17.75）ng/mL，與治療前比較，血汞含量有升高趨勢，尿汞含量明顯升高;停藥2周和停藥6周，患者血汞及尿汞含量未見明顯升高

11、。
　　 與治療前比較，治療4周、停藥2周及停藥6周，血清中ALT、AST、BUN、Cr及尿β2-MG含量未見明顯升高;治療4周，患者尿NAG含量明顯升高，停藥2周，尿NAG含量有升高趨勢，停藥6周，尿NAG含量未見明顯升高。
　　 結(jié)論
　　 慢性難愈性下肢潰瘍患者20例，患處外敷BDSJS，以0.28mg/cm2/d劑量用藥4周，在患者尿中檢測到汞含量明顯升高，血汞含量有升高趨勢;停藥6周，患者血汞及尿汞基本

12、恢復至正常水平。但治療期及停藥期BDSJS均未造成肝腎功能的明顯異常，提示，汞在機體內(nèi)短時間蓄積（血汞含量低于8.1 ng/mL，尿汞低于含量11.5ng/mL）不會導致腎損傷。該研究結(jié)果進一步證實，動物安全性實驗得出的安全劑量和周期對臨床用藥具有指導作用。
　　 1.3對不同皮膚損傷條件大鼠的腎毒性差異
　　 目的
　　 比較BDSJS對不同皮膚損傷條件大鼠的腎毒性差異。
　　 方法
　　 采用

13、BDSJS的毒性劑量，以腎臟系數(shù)、尿RBP、NAG含量及腎組織的病理形態(tài)為腎毒性觀察指標，比較其對破損皮膚和瘡瘍皮膚兩種不同皮膚損傷條件大鼠的腎毒性差異。
　　 結(jié)果
　　 與破損皮膚對照組比較，破損皮膚+BDSJS240mg/kg組大鼠的尿NAG、RBP含量明顯升高，破損皮膚+BDSJS120mg/kg組大鼠的尿NAG、RBP含量有升高趨勢，但未見顯著性差異。
　　 與潰瘍皮膚組比較，潰瘍皮膚+BDSJS240

14、及潰瘍皮膚+BDSJS120mg/kg組大鼠的尿NAG、RBP含量均見明顯升高。
　　 與相同給藥劑量的破損皮膚組大鼠比較，瘡瘍皮膚模型大鼠給予BDSJS240mg/kg與120mg/kg，大鼠的腎臟系數(shù)、尿RBP含量均明顯升高，腎組織病理學檢查見腎小管擴張及上皮細胞出現(xiàn)腫脹、脫落或呈空泡變等明顯病變。
　　 結(jié)論
　　 相同給藥劑量下，BDSJS對瘡瘍皮膚大鼠的腎毒性高于其對破損皮膚大鼠的腎毒性。提示，臨床應(yīng)用

15、含汞制劑應(yīng)高度重視創(chuàng)面深度對藥物吸收和汞蓄積的影響。
　　 2爐甘石對BDSJS中汞成分毒性的影響
　　 2.1爐甘石對紅粉所致破損皮膚大鼠腎毒性的影響
　　 目的
　　 探討爐甘石對破損皮膚大鼠汞染毒所致腎損傷有無保護作用。
　　 方法
　　 采用破損皮膚大鼠模型，以BDSJS的紅粉作為汞染毒藥物，以腎臟系數(shù)、尿NAG、RBP含量及腎病理組織形態(tài)學為毒性評價指標，探討爐甘石對汞引起的腎毒

16、性是否具有減毒作用。
　　 結(jié)果
　　 與破損皮膚對照組比較，連續(xù)給藥2周，紅粉24mg/kg(累計劑量336mg/kg)劑量組大鼠的腎臟系數(shù)和尿NAG、RBP含量明顯升高;等劑量爐甘石組大鼠的腎臟系數(shù)、尿NAG、RBP含量均無明顯改變;紅粉+爐甘石組大鼠的腎臟系數(shù)及尿NAG含量明顯升高，RBP含量有升高趨勢;與等劑量的紅粉組比較，紅粉+爐甘石組大鼠的腎臟系數(shù)有降低趨勢。
　　 與破損皮膚對照組比較，給藥1周，紅

17、粉20mg/kg(累計劑量140mg/kg)可導致大鼠的腎臟系數(shù)明顯升高，尿NAG有升高趨勢，紅粉+爐甘石組大鼠的腎臟系數(shù)明顯升高，尿NAG含量有下降趨勢。與等劑量的紅粉組比較，紅粉+爐甘石組大鼠腎臟系數(shù)有降低趨勢，NAG含量明顯下降。
　　 結(jié)論:爐甘石對汞具有一定的減毒作用，但其減毒作用與汞的用量及使用周期有關(guān)。
　　 2.2爐甘石對汞代謝的影響
　　 目的
　　 探討爐甘石對汞代謝的影響及其機制。<

18、br>　　 方法
　　 以破損皮膚大鼠為模型，以BDSJS中的紅粉為汞染毒藥物，測定血汞、尿汞、腎汞含量，采用頸動脈插管技術(shù)，觀察不同時間點血汞濃度的變化，同時采用超濾法測定血漿蛋白結(jié)合率，以探討爐甘石對血汞吸收、腎汞蓄積、尿汞排泄的影響及其機制;以GSH、MDA、T-SOD、Cu-ZnSOD及ATP含量為指標，觀察爐甘石對破損皮膚大鼠汞染毒大鼠自由基代謝的影響。
　　 結(jié)果
　　 血、尿、腎組織的汞含量:紅粉

19、24mg/kg連續(xù)用藥2周（累計劑量336mg/kg）及20mg/kg用藥1周(累計劑量140mg)，可造成破損皮膚大鼠血汞、尿汞及腎汞含量升高;紅粉累計劑量336mg/kg時，等劑量的爐甘石對紅粉組大鼠的血汞、尿汞、腎汞含量無明顯影響;紅粉累積劑量為140mg/kg時，等劑量的爐甘石可使紅粉組大鼠血汞含量下降，尿汞、腎汞含量有升高趨勢。
　　 不同時間點爐甘石對血汞濃度的影響:單次給藥后，紅粉組及紅粉+爐甘石組大鼠的血汞濃度逐

20、漸增加，紅粉組大鼠去藥8h血汞濃度達到最高值;爐甘石組大鼠去藥4h血汞達到最高值，此后血汞水平逐漸下降。
　　 血漿蛋白結(jié)合率:在大鼠及正常人血漿中，與汞25ng/L組比較，汞25ng/L+鋅組的血漿蛋白結(jié)合率有下降趨勢;在人血清白蛋白(HSA)中，與汞25ng/L組比較，汞25ng/L+鋅組的血漿蛋白的結(jié)合率明顯下降。提示，在低劑量范圍內(nèi)，鋅可能通過與汞競爭結(jié)合白蛋白，降低汞的血漿蛋白結(jié)合率。
　　 對自由基代謝的影響

21、:與破損皮膚對照組比較，紅粉20mg/kg組大鼠腎組織的MDA水平和Na+K+-ATPase活力水平明顯升高，SOD、GSH水平未見明顯改變;與紅粉組比較，紅粉+爐甘石組大鼠的腎組織MDA水平和Na+K+-ATPase活力水平明顯下降，T-SOD及Cu-ZnSOD水平有升高趨勢，GSH無明顯改變。
　　 結(jié)論
　　 爐甘石對汞具有一定的減毒作用，其機制可能是通過競爭機制降低汞與血漿白蛋白的結(jié)合，從而降低血汞濃度，加速尿汞

22、排泄;同時鋅還可通過降低汞引起大鼠腎組織MDA含量、提高SOD含量，參與自由基的代謝，保護腎組織的氧化損傷而發(fā)揮減毒作用。
　　 2.2鋅對腎小管上皮細胞汞毒性損傷的影響
　　 目的
　　 從體外角度探討鋅對人近端腎小管上皮細胞（HK-2）汞毒性損傷的作用及其機制。
　　 方法
　　 以氯化汞(HgCl2)及氯化鋅(ZnCl2)作為汞離子和鋅離子的供體，采用MTT及LDH釋放率法篩選HgCl2和Z

23、nCl2的作用濃度，并以此為基礎(chǔ)借助高內(nèi)涵成像分析技術(shù)，以細胞數(shù)、DNA含量、線粒體膜電位及細胞膜通透性為指標，探討不同劑量的鋅對汞染毒HK-2細胞的毒性作用。
　　 結(jié)果
　　 與對照組細胞比較，HgCl210、20、30μmol/L能夠明顯降低細胞數(shù)、增加DNA含量、線粒體膜電位、細胞膜通透性，并具有劑量依賴性;HgCl20.01μmol/L可導致HK-2細胞的膜電位明顯升高，對DNA含量、細胞數(shù)及通透性均無明顯影響

24、;ZnCl20.1μmol/L對HK-2細胞的細胞數(shù)、DNA含量、線粒體膜電位及通透性均無明顯影響。
　　 與對照組細胞比較，ZnCl210、20μmol/L能夠明顯抑制HgCl210、20μmol/L引起的DNA含量的異常增高，增強細胞線粒體膜電位及通透性的增高;HgCl20.01μmol/L+ZnCl20.1μmol/L可致細胞數(shù)明顯下降，細胞線粒體膜電位和膜通透性明顯升高。
　　 結(jié)論
　　 HgCl2可造