miR-141抑制HCV誘導的脂質(zhì)累積的機制研究.pdf

1、丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）感染為全球流行性疾病，嚴重威脅人類生命健康。目前HCV感染所致的慢性肝臟疾病已成為重要的健康問題，據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）統(tǒng)計，全球范圍內(nèi)HCV感染者約1.7億，每年的新生病例至少為300～400萬。此外，在HCV的急性感染期人群中，大于80％的急性感染患者因無法完全清除體內(nèi)病毒而進入慢性感染期，并隨后導致更加嚴重的并發(fā)癥以及大面積的肝臟損傷，如誘發(fā)肝硬化和肝細胞癌。目前抗HCV

2、藥物價格昂貴并存在副作用，至今尚無有效的疫苗。微小RNA（microRNA，miRNA）是一類小的、內(nèi)生性的、非編碼RNA，能夠靶向人類將近60%的mRNA，發(fā)揮廣泛的生物學作用，被認為是疾病療領域的“新靶標”。
　　已有大量研究發(fā)現(xiàn)，HCV感染能夠改變宿主細胞的miRNA表達譜，這些miRNA與HCV的生命周期密切相關。我們前期研究首次發(fā)現(xiàn)，miR-141在HCV感染者的外周血中表達較健康人群明顯降低。但miR-141在HCV感

3、染中的作用及其機制缺乏全面而深入的研究。本研究旨在鑒定miR-141在HCV感染中的生物學作用及機制，為深入了解HCV的致病機制，發(fā)現(xiàn)新的HCV治療靶標和提高療效打下基礎。在實驗室前期研究的基礎上，我們將進一步運用高表達miR-141細胞系模型，揭示miR-141在HCV感染過程中的作用及具體機制。本研究包括以下內(nèi)容：
　　目的：實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)，體外高表達miR-141能夠抑制HCV感染的Huh7細胞培養(yǎng)上清中病毒的滴度，同時

4、上調(diào)干擾素β（IFN-β）的表達，但具體機制尚不明確。HCV的整個生命周期均和脂代謝密切相關，我們的研究發(fā)現(xiàn)miR-141能夠抑制由于HCV感染所致的宿主細胞內(nèi)的脂質(zhì)累積，因此，本研究旨在通過體外實驗研究，進一步探討miR-141對HCV感染所誘導的脂質(zhì)累積的影響及機制。
　　方法：
　　1.收集HCV陽性病人外周血標本以及健康人血標本各52例，定量PCR（qRT-PCR）檢測血漿中miR-141的表達情況；
　　2.

5、 Western Blot檢測HCV蛋白core、NS5A的表達；
　　3.油紅O染色檢測高表達miR-141及對照細胞系中感染HCV前后脂滴水平；
　　4.定量PCR和 Western Blot檢測脂代謝中重要分子，包括固醇調(diào)節(jié)元件結合蛋白（Sterol Regulatory Element Binding Protein,SREBP-1,SREBP-2），脂肪酸合成酶（Fatty Acid Synthase,FASN）、

6、3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶(（3-hydroxy-3-methyl-glutaryl-CoA Reductase,HMGCR）、低密度脂蛋白受體（Low-Density Lipoprotein Receptor,LDLR）等的表達情況；
　　5. Western Blot檢測同IFN激活密切相關的c-Jun氨基末端激酶通路（JNK Pathway）中的分子，絲裂原活化蛋白激酶激酶4(Mitogen Activated P

7、rotein Kinase Kinase，MAP2K4)、絲裂原活化蛋白激酶激酶激酶激酶4(Mitogen Activated Protein Kinase Kinase Kinase Kinase,MAP4K4)以及c-Jun蛋白水平的表達；檢測IFN-β下游IFN刺激因子（IFN stimulate gene,ISGs），包括參與脂代謝的ISG膽固醇-25-羥化酶（Cholesterol25-Hydroxylase,CH25H）的m

8、RNA及蛋白表達水平；
　　6.用CH25H代謝產(chǎn)物25HC處理Huh7細胞系，比較HCV的感染情況及細胞中脂滴含量。
　　結果：與健康人血清標本相比，HCV陽性患者的血漿標本中miR-141呈顯著低表達。利用慢病毒構建的穩(wěn)定高表達miR-141的Huh7細胞系中，高表達miR-141后顯著抑制HCV core和NS5A的表達，并且能夠抑制由于病毒感染所致的細胞內(nèi)脂滴的累積；我們檢測了脂質(zhì)代謝中相關分子的表達，發(fā)現(xiàn)高表達mi

9、R-141能夠顯著抑制SREBP-1的蛋白表達水平和SREBP-1、SREBP-2、HMGCR、FASN、LDLR的mRNA水平。我們通過查閱相關文獻發(fā)現(xiàn)干擾素刺激因子CH25H能夠催化膽固醇為可溶性的25HC，25HC通過抑制脂質(zhì)代謝從而抑制多種有包膜病毒的進入過程。通過檢測 IFN通路中相關分子發(fā)現(xiàn)，miR-141能夠顯著上調(diào)JNK通路中重要的激酶MAP2K4和MAP4K4的表達及其下游c-Jun的磷酸化水平，進而增強了IFN-β啟

10、動子的活性，干擾素途徑下游的ISG56、ISG15和CH25H表達均升高。用CH25H的代謝產(chǎn)物25HC處理細胞后顯示出了抗病毒效應并逆轉(zhuǎn)了HCV感染誘導的脂質(zhì)累積，同miR-141發(fā)揮相似的作用。
　　結論：HCV感染后患者血漿中miR-141呈低表達，而體外高表達miR-141能夠抑制HCV的core和NS5A的表達，這提示，miR-141在HCV的生命周期中發(fā)揮重要的作用，而HCV對miR-141表達的抑制作用可能是其維持自

11、身生命周期的機制之一。HCV的整個生命周期均和脂質(zhì)代謝密切相關，HCV感染常常誘導肝臟中脂質(zhì)累積從而導致肝脂肪變性。我們的研究發(fā)現(xiàn)，體外高表達miR-141能夠抑制由于HCV感染所誘導的細胞內(nèi)脂質(zhì)累積。通過一系列的實驗我們發(fā)現(xiàn)，miR-141能夠通過JNK通路激活IFN-β及其下游ISGs的表達，其中的一種ISG為CH25H，它能夠?qū)⒛懝檀夹揎棾蔀榭扇苄缘?5HC，從而抑制細胞中脂質(zhì)合成和某些病毒的感染。這提示miR-141可能通過IF