膠原在胃癌發(fā)病中的作用及機(jī)制探討.pdf

1、胃癌是全球高發(fā)的惡性腫瘤之一，其相關(guān)疾病死亡率僅次于肺癌，在全球范圍內(nèi)排名第二位。胃癌預(yù)后直接取決于疾病發(fā)現(xiàn)的時(shí)期。局限于粘膜層或粘膜下層的早期胃癌是唯一可以治愈的胃癌，早期發(fā)現(xiàn)并手術(shù)切除其5年生存率往往超過90％。但是，胃癌早期缺乏特異性的癥狀，大多數(shù)患者就診時(shí)已到晚期，失去最佳手術(shù)時(shí)機(jī)，常因廣泛的侵襲轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)而死亡。而以現(xiàn)有的診斷手段，一般早期胃癌的檢出率僅15％-20％，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足臨床需要。
　　 胃癌區(qū)別于正常組織的

2、特征就是其細(xì)胞的異型性以及組織浸潤(rùn)性。然而，細(xì)胞形態(tài)學(xué)的異型性可見于胃炎性組織修復(fù)、胃粘膜腸上皮化生和異型增生或瘤樣變，唯有見到異型細(xì)胞的組織浸潤(rùn)才能確認(rèn)為癌。因此單純通過病理組織形態(tài)學(xué)水平早期診斷胃癌變得較為困難，常常難以確認(rèn)，這也成為早期胃癌檢出率低的重要原因之一。按照慢性胃炎.萎縮性胃炎-腸上皮化生.不典型增生、胃癌的胃癌變假說來推理，如果對(duì)主要的胃癌前病變實(shí)施動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，從尋找腫瘤浸潤(rùn)的特征性生物學(xué)行為著手，研究癌前病變癌變的分子

3、生物學(xué)標(biāo)志物，查找異型細(xì)胞浸潤(rùn)組織的分子證據(jù)，就能夠準(zhǔn)確地判別癌前病灶癌變，在病理形態(tài)學(xué)改變前甄別出早期胃癌，達(dá)到早期診斷胃癌目的，為早期治療和治愈胃癌奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
　　 基于腫瘤分子水平的診斷及其機(jī)制的研究逐漸成為熱點(diǎn)，并已經(jīng)顯示出腫瘤早期診斷及分子干預(yù)特別優(yōu)勢(shì)。例如，利用芯片技術(shù)建立了胃癌早期診斷的基因預(yù)警系統(tǒng)和采用小RNA干擾技術(shù)抑制癌變。我們以前的相關(guān)基因芯片篩查結(jié)果顯示，膠原系列的基因表達(dá)在胃癌中存在明顯的異常表達(dá)

4、。本課題作為深入研究，將基因芯片篩查得到的膠原系列基因進(jìn)行進(jìn)一步的定量Real-time PCR技術(shù)檢測(cè)，從中篩選可能用于胃癌早期診斷的膠原標(biāo)記，建立胃癌前病變癌變判別和胃癌早期分子診斷的模型，同時(shí)采用現(xiàn)代細(xì)胞與分子生物學(xué)技術(shù)，通過體外胃癌細(xì)胞模型研究胃癌中高表達(dá)I型間質(zhì)膠原在胃癌發(fā)病中的作用機(jī)制，應(yīng)用RNA干擾技術(shù)對(duì)胃癌細(xì)胞I型膠原實(shí)施干預(yù)試驗(yàn)，研究COLlA1基因?qū)?xì)胞生物學(xué)行為的影響及可能機(jī)制，為胃癌早期診斷和分子治療提供科學(xué)的依

5、據(jù)。
　　 一材料和方法：
　　 1收集手術(shù)確診的胃癌患者，取同一個(gè)體不同區(qū)域胃粘膜組織樣本（癌組織，癌旁癌前病灶及癌切除遠(yuǎn)端近似正常的胃組織），通過定量Real-time PCR分三階段檢測(cè)8個(gè)膠原基因( COLlA1，COLlA2，COL3A1，COL4A6，COL6A3，COL8A1，COL10A1，COL11A1)mRNA在這些組織中的表達(dá)情況。使用單因素方差分析或非參數(shù)檢驗(yàn)逐一分析各個(gè)膠原基因在胃癌，癌前病灶及

6、相對(duì)正常組織中的組間表達(dá)差異。將有判癌價(jià)值的膠原系列基因在相對(duì)正常，癌前病灶，早期胃癌及進(jìn)展期胃癌不同個(gè)體同類樣本中的表達(dá)情況進(jìn)行Binary Logistic回歸分析（癌與非癌），采用Forward:condiTiO2al法，作胃癌與非癌判別，以建立胃癌早期診斷的分子生物信息學(xué)判別公式。進(jìn)一步將判別公式在不同個(gè)體、不同類別樣本中進(jìn)行驗(yàn)證并作修正，以獲得高敏感性、高特異性的判癌公式。
　　 2通過體外細(xì)胞模型，探討經(jīng)PCR驗(yàn)證在

7、胃癌組織中明顯高表達(dá)的I型膠原作為細(xì)胞生長(zhǎng)的微環(huán)境，對(duì)胃癌細(xì)胞生物學(xué)行為（形態(tài)學(xué)，細(xì)胞骨架，遷徙及增殖）的影響，通過檢測(cè)相關(guān)通路蛋白及基因的改變探討其可能的作用機(jī)制。
　　 3使用COLlAI-shRNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)染BGC-823胃癌細(xì)胞株，干擾癌細(xì)胞I型膠原主要基因COLlA1的表達(dá)，通過MTT及Transwell檢測(cè)研究COLlAlRNA干擾對(duì)胃癌細(xì)胞增殖及遷移的影響。
　　 二主要結(jié)果：
　　 1①第一階段

8、收集22個(gè)胃癌手術(shù)患者男性19例，女性3例，包括腫瘤部位，癌前病變部位及遠(yuǎn)端正常部位組織的同個(gè)體配對(duì)病理樣本66個(gè)。8個(gè)膠原基因定量Real-time PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與癌旁癌前病變組織配對(duì)的樣本比較，除COL10A1外，腫瘤組織中有6個(gè)膠原基因( COLlA1，COLlA2，COL3A1， COL6A3，COL8A1，COL11A1)表達(dá)明顯上調(diào)（P<0.05）。一個(gè)膠原基因(COL4A6)表達(dá)下調(diào)(P<0.05)。
　　 ②

9、第二階段收集33個(gè)不同疾病狀態(tài)患者包括癌前病變11例，早期胃癌11例，進(jìn)展期胃癌11例不同個(gè)體的共33個(gè)配對(duì)病理樣本入組。各組均為男性8例，女性3例。7個(gè)基因定量Real-time PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與癌前病變組相比，COL11A1在胃癌中表達(dá)明顯上調(diào)，尤其在早期胃癌中更明顯（P<0.05），而COL4A6在胃癌中的表達(dá)則明顯下調(diào)（P<0.05）。根據(jù)系列膠原基因在胃癌及癌前期病變組織中的相對(duì)表達(dá)值，采用Binary Logistic回歸

10、分析，作癌與非癌判別，結(jié)果有3個(gè)膠原基因( COL11A1，COL8A1，COL4A6)進(jìn)入回歸方程，初步建立了基于膠原系列基因PCR表達(dá)水平的胃癌早期診斷的分子生物信息學(xué)判別公式。
　　 ③第三階段共收集106個(gè)不同患者，男性61例，女性45例，采取不同類別的樣本共106個(gè)，包括胃鏡檢查基本正常的20例，癌前病變28例，胃癌58例。4個(gè)膠原基因在胃癌及癌前病灶組織表達(dá)存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，其中COLlA1，1A2，11A1在胃癌組織

11、高表達(dá)(P<0.05)，而COL4A6則低表達(dá)(P<0.05)。根據(jù)系列膠原基因在胃癌及癌前期病變組織中的相對(duì)表達(dá)值，對(duì)第二階段提出的公式進(jìn)行驗(yàn)證，再次經(jīng)過Binary logistic回歸分析修正了基于膠原系列基因PCR表達(dá)水平的胃癌癌變預(yù)測(cè)公式，修正后公式的敏感性和特異性分別達(dá)91.4％和91.7％。
　　 2①體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，常規(guī)培養(yǎng)三株不同分化程度的胃癌細(xì)胞株，在膠原刺激后細(xì)胞變形，胞體伸展，表面突起增多，呈現(xiàn)明顯增多

12、的絲狀偽足和片狀偽足，細(xì)胞內(nèi)微絲明顯拉長(zhǎng)增粗。
　　 ②Transwell細(xì)胞遷移試驗(yàn)表明，在外膜涂有I型膠原的小室內(nèi)的胃癌細(xì)胞通過膜的細(xì)胞較未涂膠原組明顯增多，提示I型膠原可以明顯提高胃癌細(xì)胞的遷移能力，這與膠原刺激后細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變相一致。
　　 ③相關(guān)通路研究提示：膠原刺激主要使E-cadherin/catenin粘附復(fù)合體減少，可溶性的E-cadherin，β-catenin也有輕度下降。提示膠原促進(jìn)E-cadhe

13、rin/catenin粘附復(fù)合體解聚，破壞細(xì)胞間的粘附連接，這些結(jié)果可能與FAK磷酸化，β-catenin酪氨酸磷酸化及與β-catenin結(jié)合的PTEN下調(diào)有關(guān)。
　　 ④MTT試驗(yàn)表明：胃癌細(xì)胞在鋪有膠原的平板內(nèi)生長(zhǎng)速度明顯高于未鋪膠原組，提示膠原可促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖。膠原刺激不僅使胃癌細(xì)胞β-catenin酪氨酸磷酸化，E-cadherin/catenin復(fù)合體解聚，而且使細(xì)胞核內(nèi)β-catenin表達(dá)上調(diào)，促使其核轉(zhuǎn)位。且

14、3株分化程度不同的細(xì)胞株在膠原刺激后，cyclin D1表達(dá)均明顯上調(diào)，尤其是NCI-N87上調(diào)最明顯，達(dá)對(duì)照組的3倍。
　　 3①我們將已構(gòu)建并經(jīng)測(cè)序鑒定的COLlAI-shRNA質(zhì)粒載體進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，G418篩選，獲得3個(gè)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染COLlAl-shRNA細(xì)胞（COLlAl-shRNA-1，COLlAl-shRNA-2，COLlAl-shRNA-3）及陰性載體對(duì)照細(xì)胞(Negativecontrol)。轉(zhuǎn)染后見部分細(xì)胞邊緣圓，

15、細(xì)胞核濃縮，細(xì)胞中顆粒增多，細(xì)胞碎片增多，細(xì)胞增殖減慢且易脫落。
　　 ②Real-time PCR結(jié)果示相對(duì)于Blank control組，COLlAl-shRNA-1，COLlAI-shRNA-2，COLlAI-shRNA-3轉(zhuǎn)染組細(xì)胞COLlAl mRNA的表達(dá)明顯下調(diào)，尤以COLlAI-shRNA-1轉(zhuǎn)染組效果明顯，被抑制了8±0.2倍(P<0.01)。
　　 ③MTT試驗(yàn)表明：COLlAI-shRNA-I轉(zhuǎn)染組

16、細(xì)胞增殖減慢，在各實(shí)驗(yàn)點(diǎn)其A值均明顯低于Negative control及Blank control(P<0.05)。
　　 ④Transwell遷移試驗(yàn)表明：COLlAI-shRNA-1轉(zhuǎn)染組細(xì)胞明顯少于Negativecontrol及Blank control，其細(xì)胞數(shù)量減少超過3倍以上(P<0.05)，提示COLlA1干擾可明顯抑制胃癌BGC-823細(xì)胞遷移。
　　 三結(jié)論：
　　 1發(fā)現(xiàn)2個(gè)膠原基因( C

17、OL4A6，COLllAl)可能作為胃癌前病變?cè)缙诎┳儽O(jiān)測(cè)指標(biāo)，COLllA1可能是更為敏感的監(jiān)測(cè)指標(biāo)。
　　 2初步建立起了基于膠原系列基因表達(dá)水平的胃癌前期病灶癌變判別公式，對(duì)臨床早期胃癌的生物學(xué)診斷提出新的診斷模式。
　　 3I型膠原可誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞骨架重組，促進(jìn)細(xì)胞增殖及遷移，主要與β-catenin酪氨酸磷酸化及核轉(zhuǎn)位有關(guān)。
　　 4成功建立和篩選體外穩(wěn)定轉(zhuǎn)染COLlAI-shRNA的胃癌BGC-823細(xì)