慢性微量鉻(Ⅵ)暴露對小鼠肝細胞氧化應(yīng)激的影響.pdf

1、背景
　　 自1988年第二代金屬對金屬(Metal-on-Metal，MOM)關(guān)節(jié)由B.G.Weber應(yīng)用于臨床以來，每年有超過275000例Metasul關(guān)節(jié)在全球范圍內(nèi)被植入人體，被認為對于年輕且活躍的病人較為適用。金屬對金屬髖關(guān)節(jié)假體按照是否保留股骨頸可分為金屬對金屬全髖關(guān)節(jié)假體及表面髖關(guān)節(jié)假體。因其具有良好的剛度和強度、優(yōu)越的抗磨損性和耐腐蝕性，被認為具有良好的應(yīng)用前景。然而，金屬假體植入人體后不斷承受彎曲、撞擊、摩擦

2、等機械外力作用，將導(dǎo)致關(guān)節(jié)假體表面惰性氧化層的破壞，導(dǎo)致金屬離子不斷釋放。現(xiàn)在普遍認為MOM假體植入術(shù)后會引起人體金屬離子濃度的升高。Sauve等經(jīng)過30年的隨訪研究發(fā)現(xiàn)，使用MOM關(guān)節(jié)假體的患者其血清中鈷、鉻金屬離子濃度較對照組升高3-5倍。Maezawa,K.等對44例行金屬對金屬全髖關(guān)節(jié)置換的患者進行了為期7年的隨訪研究發(fā)現(xiàn)，患者術(shù)后3年血中金屬離子濃度逐漸增加，至后4年會有25％的患者金屬離子濃度有所下降，但仍會有16.3％的患

3、者金屬離子濃度逐漸升高。我國學(xué)者曾對25例行表面髖關(guān)節(jié)置換的患者進行了2年隨訪，結(jié)果顯示患者術(shù)后6月內(nèi)金屬離子濃度逐漸上升，以后逐漸下降趨于平穩(wěn)，但仍高于正常值。多中心臨床研究已證實:與金屬對聚乙烯假體相比，MOM會產(chǎn)生較少的磨損顆粒，但假體周圍、血液及組織中的金屬離子濃度較高。
　　 隨著現(xiàn)代冶金技術(shù)及生物材料的發(fā)展，鈷鉻合金（其中鉻含量約占50-70％）因有較好的理學(xué)及機械學(xué)特性，已成為當代金屬對金屬髖關(guān)節(jié)假體的主要材料。隨

4、著假體的植入，鉻會不斷的緩慢釋放從而對人體產(chǎn)生影響。目前，大多數(shù)研究集中于金屬離子對假體周圍的骨組織、軟組織以及免疫細胞等的影響:①假體周圍不斷釋放的金屬離子對于周圍軟軟組織的影響。如引起炎性假瘤等。②假體無菌性松動。假體松動是THR后中、晚期最主要的并發(fā)癥之一，大部分學(xué)者認為假體松動主要是因為假體周圍骨溶解引起。③金屬離子能夠誘導(dǎo)單核細胞及巨噬細胞釋放多種細胞因子，從而引起免疫反應(yīng)。肝臟是人體最大的解毒腺體，具有及其復(fù)雜多樣的生物化學(xué)

5、功能。體內(nèi)包括鉻在內(nèi)的金屬離子均需在肝細胞內(nèi)進行生物學(xué)轉(zhuǎn)化。當前，對于來源于假體的不斷釋放的鉻離子對遠隔靶器官如肝臟的生物學(xué)影響研究尚不多。
　　 鉻是人體必需的微量元素之一，其在體內(nèi)的含量隨著年齡的增大而逐漸減少。生理劑量的鉻對血糖及膽固醇的調(diào)節(jié)具有重要作用。鉻在體內(nèi)主要以三價和六價形式存在。毒理學(xué)及環(huán)境衛(wèi)生學(xué)的研究已經(jīng)證實，短時間大量的鉻離子進入人體會引起肝細胞細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的改變，從而引起酶學(xué)、形態(tài)學(xué)等不可逆的損傷，甚至

6、凋亡。鉻離子毒性與其存在的價態(tài)有極大的關(guān)系，六價鉻的毒性比三價鉻高約100倍。六價鉻(Ⅵ)經(jīng)非特異性的陰離子通道進入肝細胞，并在肝細胞內(nèi)通過酶類或非酶類的方式轉(zhuǎn)化為毒性較小的三價鉻(Ⅲ)，此過程會引起細胞的氧化應(yīng)激，從而產(chǎn)生大量的過氧化物。產(chǎn)生的大量過氧化物會通過級聯(lián)瀑布式的反應(yīng)引起脂質(zhì)過氧化及DNA損傷。而細胞為對抗此反應(yīng)，會啟動包括超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)、谷胱甘肽還原酶(GR)及谷氨酸半胱氨酸連接酶(GCL)等

7、的抗氧化應(yīng)激系統(tǒng)，清除自由基，以維持細胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。
　　 當前的金屬對金屬髖關(guān)節(jié)假體中，鉻存在并釋放入血的主要形式是六價的。與毒理學(xué)及環(huán)境衛(wèi)生學(xué)的研究不同，MOM髖關(guān)節(jié)假體植入人體后，鉻(Ⅵ)離子釋放是一個緩慢且微量的過程。金屬假體的腐蝕度通常為0.15-0.3μg/cm2/h或30μ/d，或11mg/年，血鉻含量大量文獻報道在2.6-26μg/L之間，且時間窗較長（當代金屬對金屬假體壽命一般在十年以上）。緩慢釋放的微量鉻(

8、Ⅵ)是否使肝細胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激？肝細胞內(nèi)的抗氧化應(yīng)激系統(tǒng)的反應(yīng)如何？因此，明確鉻(Ⅵ)對靶器官肝臟的氧化應(yīng)激的影響對于評估MOM假體的安全性具有重要意義。
　　 目的
　　 1、構(gòu)建慢性微量鉻(Ⅵ)暴露小鼠慢性模擬金屬對金屬髖關(guān)節(jié)植入人體后引起的鉻(Ⅵ)緩慢釋放
　　 2、探討慢性微量鉻(Ⅵ)暴露是否會引起小鼠肝細胞的氧化應(yīng)激。
　　 3、探討慢性微量鉻(Ⅵ)暴露是否引起小鼠肝細胞抗氧化應(yīng)激系統(tǒng)的改變以及發(fā)

9、生何種改變。
　　 4、探討金屬對金屬假體對遠隔靶器官肝臟的安全性問題。
　　 材料和方法
　　 按照實驗設(shè)計，將80只NIH小鼠隨機分為4組（對照組，低、中、高劑量組），每組20只，雌雄不限。CrO3染毒組劑量分別為0mg/kg、5mg/kg、10mg/kg和20mg/kg,隔日腹腔注射1次，實驗持續(xù)16周，分別于染毒4周末，第8周末，第12周末，第16周末用頸椎脫位法各處死小鼠5只，小鼠處死前進行眼球摘除取血

10、，肝素抗凝后進行血鉻含量的檢測。一部分肝組織進行HE染色光鏡觀察，并進行透射電鏡觀察，余下肝組織用冰冷的生理鹽水洗凈，加入緩沖液后研磨成勻漿分裝后迅速置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆?，檢測肝細胞活性氧自由基水平(ROS)、脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛含量(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽活性(GSH)、谷胱甘肽還原酶(GR)活性及谷氨酸半胱氨酸連接酶(GCL)的表達。
　　 結(jié)果
　　 1、0mg/kg、5mg/kg組在染毒

11、4周后，血鉻含量達峰值，隨后維持在一定濃度，達到一個平臺期。而對于20mg/kg組，血鉻濃度持續(xù)升高，未見明顯的平臺期。
　　 2、實驗各組小鼠肝細胞ROS值均高于對照組，且差別具有統(tǒng)計學(xué)意義。并且觀察到隨著染毒時間的延長，低中劑量組ROS會逐漸接近一個平臺期，而對20mg/kg組，ROS持續(xù)升高，未見明顯的平臺期。這與結(jié)果1相似。
　　 3、在各個時間點中，20mg/kg組MDA含量較0mg/kg組升高，但差別無統(tǒng)計學(xué)

12、意義。
　　 4、與對照組相比，5mg/kg組、10mg/kg組在第4周CAT水平未見明顯降低，差別無統(tǒng)計學(xué)意義;而在隨后的各個時間點中升高明顯，且差別具有統(tǒng)計學(xué)意義。與對照組相比，20mg/kg組隨著染毒時間的延長CAT水平下降明顯，且差別具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 5、與對照組相比，小鼠經(jīng)鉻染毒4周后20mg/kg組SOD降低，并具有顯著性差異。8周以后隨著染毒時間的延長，各組SOD活性下降明顯，且差別具有統(tǒng)計意義。

13、r>　　 6、與對照組相比，5mg/kg組、10mg/kg組在第4周GSH水平未見明顯降低，差別無統(tǒng)計學(xué)意義;而在隨后的各個時間點中升高明顯，且差別具有統(tǒng)計學(xué)意義。與對照組相比，20mg/kg組隨著染毒時間的延長GSH水平下降明顯，且差別具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 7、與對照組相比在染毒的第4周5mg/kg組、10mg/kg組GR活性升高，差別具有統(tǒng)計學(xué)意義;20mg/kg組下降明顯，且差別具有統(tǒng)計學(xué)意義.隨著染毒時間的延長各劑量

14、組GR水平均下降，且與對照組相比，差別具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 8、GCL表達的蛋白條帶用image-proPlus圖像分析系統(tǒng)對條帶灰度進行掃描，掃描結(jié)果顯示:5mg/kg組、10mg/kg組各個時間點GCL表達明顯升高，與對照組相比，具有統(tǒng)計學(xué)意義。而20mg/kg組GCL表達在第8周后下降明顯，差別具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 9、肝細胞HE染色顯示:與對照組相比，5mg/kg組、1Omg/kg組肝細胞未見明顯異常。而20

15、mg/kg組肝細胞在第16周可見少量的空泡變，細胞膜稍皺縮。透射電鏡顯示:與對照相比，高劑量染毒小鼠在第16周超微結(jié)構(gòu)出現(xiàn)凋亡特征性改變:細胞核皺縮，染色質(zhì)濃縮并發(fā)生邊聚化;線粒體變的致密，峭消失，空泡化改變。
　　 結(jié)論
　　 1、隨著染毒時間的延長，慢性微量鉻(Ⅵ)染毒會引起小鼠血鉻含量的升高，且具有一定的濃度時間依賴性。
　　 2、慢性微量鉻(Ⅵ)暴露會引起小鼠肝細胞的氧化應(yīng)激，提示金屬對金屬髖關(guān)節(jié)置換術(shù)后