脈沖電磁場對小鼠胚胎干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的作用研究.pdf

1、研究背景: 骨組織工程的關(guān)鍵是成骨細(xì)胞成骨以修復(fù)骨缺損，其前提是找到良好的種子細(xì)胞。目前常用的種子細(xì)胞有骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal Stem Cells，MSCs)和胚胎干細(xì)胞(Embryonic stem cells，ESCs)，但MSCs在骨髓中所占的比例極低，難以純化，細(xì)胞生物學(xué)功能易受傳代次數(shù)和年齡因素等影響。ESCs來源于哺乳動物的囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和原始生殖細(xì)胞，具有全能分化和無限增殖兩大特性。作為最有希望成

2、為骨組織工程的種子細(xì)胞，其向成骨細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化的數(shù)量和功能狀態(tài)是影響組織工程骨的成骨效果的主要因素之一。目前誘導(dǎo)ESCs分化為成骨細(xì)胞的方法主要是添加化學(xué)誘導(dǎo)劑，然而這種誘導(dǎo)方法的成骨細(xì)胞分化率較低，難以滿足組織工程對種子細(xì)胞巨大數(shù)量的要求。 脈沖電磁場(Pulsed electromagnetic fields，PEMFs)作為一種安全、簡便、有效的治療手段已廣泛用于臨床治療骨折后骨不連或延遲愈合及假關(guān)節(jié)等，而且低頻、低場強

3、的PEMFs不會導(dǎo)致基因突變及染色體畸變。因此將PEMFs應(yīng)用于骨組織工程有重要意義。我們前期的研究表明，特定場強和頻率的PEMFs能促進(jìn)骨髓MSCs向成骨細(xì)胞分化?？紤]ESCs和MSCs在很多方面都有相似性，特別是對相同的成骨誘導(dǎo)劑具有基本相同的反應(yīng)，所以我們推測脈沖電磁場對ESCs向成骨細(xì)胞的分化也起作用。 研究目的: 本課題以小鼠ESCs為觀察對象，以化學(xué)誘導(dǎo)為對照，施加PEMFs刺激，觀察其對小鼠ESCs向成骨細(xì)

4、胞分化的作用，為探索誘導(dǎo)ESCs向成骨細(xì)胞分化的方法提供全新的策略。 材料和方法: 1、小鼠胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)及鑒定：復(fù)蘇C57BU6X129小鼠ESCs(廣州賽業(yè))，以小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(mouse embryonic fibroblast，MEF)為飼養(yǎng)層，在含有白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor， LIF)的培養(yǎng)液中進(jìn)行擴增培養(yǎng)，并行堿性磷酸酶(AKP)染色檢測其未分化性。 2

5、、成骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化：小鼠ESCs經(jīng)懸浮培養(yǎng)形成胚胎體(Embryonic Bodies，EBs)，在EBs形成第5天收集細(xì)胞并按5×104ml-1的密度接種到細(xì)胞培養(yǎng)板，在DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)液中使胚胎體單細(xì)胞貼壁培養(yǎng)。于EBs分化第5+14d開始，分別給予脈沖電磁場、化學(xué)誘導(dǎo)劑以及聯(lián)合刺激。采用茜素紅染色、骨鈣素(osteocalcin，OC)免疫組織化學(xué)染色、成骨分化關(guān)鍵因子Osterix和Cbfa-1/Runx-2的Real-time

6、 PCR檢測等方法觀測成骨分化情況。 研究結(jié)果: 1、小鼠胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)及鑒定 ESCs接種到經(jīng)Y射線預(yù)處理過的飼養(yǎng)層后24h，細(xì)胞貼附于MEF上呈克隆性生長，由幾個到幾十個細(xì)胞組成。48h后ESCs克隆體積增大數(shù)倍，呈明顯的細(xì)胞集落。選取生長旺盛的ESCs行堿性磷酸酶染色，克隆呈藍(lán)紫色團(tuán)塊，而飼養(yǎng)層細(xì)胞不著色。 2、成骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化 (1)茜素紅染色顯示：PEMFs組、誘導(dǎo)培養(yǎng)基組、聯(lián)合培養(yǎng)組

7、中鈣結(jié)節(jié)面積分別比對照組升高了123％、229％、262％，P<0.01。其中，聯(lián)合培養(yǎng)組與PEMFs組相比，鈣結(jié)節(jié)面積升高了62010，P<0.01。聯(lián)合培養(yǎng)組與誘導(dǎo)培養(yǎng)基組相比，鈣結(jié)節(jié)面積升高了10％，P<0.05。 (2)骨鈣素免疫組織化學(xué)染色顯示：PEMFs組、誘導(dǎo)培養(yǎng)基組、聯(lián)合培養(yǎng)組中可見陽性綠色熒光顆粒，而對照組為陰性。其中又以聯(lián)合培養(yǎng)組中骨鈣素分泌最多。 (3) Real-time PCR檢測顯示：PEMF

8、s組、誘導(dǎo)培養(yǎng)基組、聯(lián)合培養(yǎng)組中Osterix的表達(dá)水平分別是對照組的1.3(P<0.05)、2.2(P<0.01)、4.1(P<0.01)倍。其中聯(lián)合培養(yǎng)組中Osterix的表達(dá)最高，與PEMFs組和誘導(dǎo)培養(yǎng)基組相比，P<0.01，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。PEMFs組、誘導(dǎo)培養(yǎng)基組、聯(lián)合培養(yǎng)組中Cbfa-1/Runx-2的表達(dá)水平分別是對照組的1.4(P<0.05)、2.1(P<0.01)、2.9(P<0.01)倍。其中聯(lián)合培養(yǎng)組中Cbf

9、a-1/Runx-2的表達(dá)最高，與PEMFs組和誘導(dǎo)培養(yǎng)基組相比，P<0.01，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。 研究結(jié)論: 以γ射線預(yù)處理的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞作為飼養(yǎng)層，結(jié)合1000IU/ml的LIF，能有效地維持ESCs的增殖能力和未分化狀態(tài)。脈沖電磁場可以促進(jìn)小鼠胚胎干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化，而且脈沖電磁場和常規(guī)化學(xué)誘導(dǎo)劑聯(lián)合應(yīng)用會產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)，其成骨誘導(dǎo)效果優(yōu)于兩者單獨應(yīng)用。脈沖電磁場促進(jìn)ESCs向成骨細(xì)胞分化的機制可能與BMP