miR-122調控小鼠胚胎干細胞向肝細胞分化的初步研究.pdf

1、肝炎、肝硬化、原發(fā)性肝癌、先天性膽道閉鎖、先天性酶缺乏性肝病和急性肝功能衰竭等難治性肝病、終末期肝病為全球醫(yī)療棘手問題，肝細胞移植(hepatocyte transplantation,HTx)為解決這些問題提供了新的途經(jīng)，有可能與原位肝移植(orthotopic liver transplantation,OLT)一樣成為上述疾病的可供選擇的替代治療方法。然而，由于肝細胞來源短缺、增殖困難等方面的限制，HTx的臨床應用研究進展仍相當緩

2、慢。
　　 人類胚胎干細胞(embryonic stem cell，ESC)建系成功無疑為解決細胞移植供體(種子)來源問題帶來了希望。ESC具有無限的增殖潛能和發(fā)育的全能性，理論上，它可在特定條件下定向分化為成體所有種類的細胞，從而為細胞移植提供源源不斷的種子細胞來源。目前已有不少成功在體外通過自發(fā)分化或者外源性因子的誘導將ESC誘導分化為肝細胞的報道，然而，由于對胚胎發(fā)育過程中基因激活與沉默的機制以及胚層、組織和細胞間的信息調

3、控網(wǎng)絡所知甚少，我們尚難以全面、有序地掌控ESC定向分化為肝細胞的進程，所獲取的目的細胞在分化效率、均質性等方面離臨床應用尚相距甚遠。
　　 ESC體外分化被認為是人體組織細胞發(fā)育的重演，其中涉及了基因有序地激活與沉默、增強與衰減，而眾多轉錄調節(jié)機制精確地控制這一進程。microRNA(miRNA)是廣泛存在于真核細胞內的轉錄后基因調節(jié)機制，在細胞生長與分化過程中扮演著極為重要的角色。目前已初步證明，miR-122在肝臟特異性高

4、表達，并且在調控肝臟發(fā)育、肝細胞代謝等方面起著重要作用。
　　 為探索miR-122在ESC分化為肝細胞過程中的調控作用與機制，我們初步進行了如下的實驗研究：
　　 1.細胞因子、丁酸鈉聯(lián)合誘導小鼠胚胎干細胞向肝細胞分化常規(guī)培養(yǎng)E14小鼠ES細胞后，繼續(xù)懸滴培養(yǎng)3 d以形成擬胚體，然后轉移擬胚體到6孔板中并添加FGF-410ng/ml、HGF20ng/ml、丁酸鈉2.5mmol/L進行誘導分化。分化過程中用倒置相差顯微鏡

5、觀察細胞形態(tài)學的改變；免疫熒光染色觀察肝細胞特異性標志白蛋白(ALB)、甲胎蛋白(AFP)、細胞角蛋白18(CK18)的表達；RT-PCR檢測肝細胞特異性標志基因ALB、AFP、甲狀腺素運載蛋白(TTR)的mRNA表達；流式細胞技術檢測ALB陽性細胞比例；尿素合成功能檢測則對其功能進行檢驗。結果顯示：誘導分化過程中ES細胞逐漸出現(xiàn)肝細胞樣改變；誘導分化第7d僅檢測到AFP和TTR在mRNA水平的表達；第14 d檢測到ALB在mRNA水平

6、的表達；分化14 d時免疫熒光檢測顯示ALB、AFP、CK18均為陽性；流式細胞技術檢測ALB陽性細胞比例約為68.23％；尿素合成功能檢測見培養(yǎng)液內尿素氮的逐日升高，顯示分化14d的肝細胞樣細胞具有肝細胞功能。
　　 2.誘導分化過程中miR-122表達水平的檢測以誘導開始記為0d，分別取0d，3d，6d，9d，12d，15d細胞約105～106，采用quantitative Real-time PCR技術檢測miR-122表

7、達水平，各時間點檢測重復3次，以均值繪制miR-122的時序表達曲線，結果顯示在ESC體外誘導分化為肝細胞的各個時期miR-122表達都處于較低水平，但分化第9天細胞miR-122表達較前有明顯上調。
　　 3.miR-122真核表達載體的構建從小鼠基因組DNA擴增pre-miR122，克隆至pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP逆轉錄病毒載體上，測序鑒定，病毒包裝后，轉染NIH3T3細胞，并通過綠色熒光蛋白進行病毒滴度

8、測定。結果顯示成功構建表達miR-122的慢病毒載體，病毒的滴度為(1～5)×106 IU/mL。
　　 以上結果明確了細胞因子、丁酸鈉聯(lián)合可以有效誘導小鼠胚胎干細胞分化為肝細胞樣細胞，并且分化細胞具有部分肝細胞功能；體外誘導分化過程中，ESC分化為肝細胞的各個時期miR-122表達都處于較低水平，但分化第9天細胞miR-122表達較前有明顯上調，對miR-122表達載體轉染時間點確定具有指導意義；成功構建出miR-122慢病毒