核基因CDKAL1、KCNQ1和線粒體DNA T16189C變異與2型糖尿病的關(guān)聯(lián)分析.pdf

1、目的：
　　 1.驗(yàn)證2型糖尿病(T2DM)易感基因CDKAL1 rs7756992位點(diǎn)和KCNQ1 rs2237892位點(diǎn)與中國(guó)漢族人群T2DM的關(guān)聯(lián)。
　　 2.分析rs7756992（CDKAL）和rs2237892(KCNQ1)不同基因型與T2DM臨床特征和糖尿病慢性并發(fā)癥的關(guān)聯(lián)，為浙江省溫州地區(qū)易感人群的篩選和疾病分子分型提供基礎(chǔ)。
　　 3.分析線粒體DNA單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)T16189C變異與中國(guó)漢

2、族人群T2DM的關(guān)聯(lián)，為T2DM的研究提供新的依據(jù)。
　　 方法：
　　 1.研究對(duì)象:所有研究對(duì)象均來(lái)自于浙江省溫州地區(qū)漢族人群，其中病例組為溫州醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院內(nèi)分泌科住院部2009年3月-2011年10月期間確診的2型糖尿病患者，而非糖尿病對(duì)照組人群為2009年12月-2011年10月期間于溫州市體檢中心參加體檢的體檢者。本研究經(jīng)過(guò)溫州醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，調(diào)查和取樣均征得參與者本人同意并簽署了知情同

3、意書(shū)。
　　 2.標(biāo)本DNA提取:使用專用的血液DNA提取試劑盒及磁珠提取法，對(duì)收集的樣本進(jìn)行全基因組DNA提取，并用NanoDrop2000分光光度計(jì)測(cè)定其濃度和純度后，保存在-30℃冰箱備用。
　　 3.基因分型:采用高分辨率熔解曲線(HRM)技術(shù)區(qū)分樣本基因型。首先設(shè)計(jì)兩對(duì)HRM特異性引物，然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增和HRM基因分型，最后使用LightCycler(@)480 Gene scanning軟件自動(dòng)化分組功能進(jìn)

4、行結(jié)果分析。另外，隨機(jī)抽取病例-對(duì)照組標(biāo)本各20例進(jìn)行DNA直接測(cè)序，驗(yàn)證HRM技術(shù)的特異性和靈敏度。
　　 4.PCR擴(kuò)增技術(shù)和DNA直接測(cè)序技術(shù):選取包含線粒體DNA16189C和一些多態(tài)性位點(diǎn)的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物純化后進(jìn)行DNA直接測(cè)序，測(cè)序結(jié)果用DNA Star等相關(guān)軟件與劍橋參考序列進(jìn)行分析。
　　 5.數(shù)據(jù)分析:CDKAL1計(jì)量資料呈正態(tài)分布變量用X±S表示，非正態(tài)分布用中位數(shù)（四分位間距）

5、表示，而KCNQ1和T16189C的所有計(jì)量資料均用X±S表示。兩組臨床基本特征分析中，非正態(tài)分布變量經(jīng)對(duì)數(shù)變量變換后轉(zhuǎn)為正態(tài)后使用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，而未轉(zhuǎn)為正態(tài)的變量用秩和檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料（性別）用x2檢驗(yàn)分析。 Hardy-Weinberg平衡試驗(yàn)檢驗(yàn)本研究所選樣本是否具有群體代表性。rs7756992位點(diǎn)和rs2237892位點(diǎn)基因型和等位基因頻率與T2DM發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)和糖尿病慢性并發(fā)癥關(guān)聯(lián)分析用例數(shù)(％)表示，使用x2檢驗(yàn)和二項(xiàng)Logi

6、stic回歸分析，與T2DM患者臨床特征分析使用單因素方差分析（ANO VA）和多元線性回歸分析。16189C和一些多態(tài)性位點(diǎn)組成的單體型在病例-對(duì)照組中的分布用例數(shù)(％)表示，使用x2檢驗(yàn)進(jìn)行分析。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且所有數(shù)據(jù)用SPSS17.0軟件包統(tǒng)計(jì)分析。
　　 結(jié)果：
　　 1.在浙江溫州地區(qū)漢族人群中，CDKAL1基因rs7756992位點(diǎn)基因型GG/AA(P=0.048)和等位基因A/G(P=

7、0.045)在T2DM組和對(duì)照組間差異顯著，證實(shí)G為該位點(diǎn)風(fēng)險(xiǎn)等位基因。
　　 2.對(duì)T2DM組內(nèi)不同基因型的臨床特征分析發(fā)現(xiàn)，rs7756992位點(diǎn)GG基因型T2DM患者空腹血糖濃度偏低（年齡/性別校正后，P＜0.001）而HbAl c值未見(jiàn)差異。
　　 3.T2DM患者中，rs7756992位點(diǎn)等位基因和基因型頻率在各種糖尿病慢性并發(fā)癥間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 4.在浙江溫州地區(qū)漢族人群中，KCNQ1基

8、因rs2237892位點(diǎn)等位基因C/T(P＜0.001)、基因型CC/TT(P＜0.001)、基因型CC/(CT+TT)（P=0.006）和基因型(CC+TT)/TT(P＜0.001)在T2DM組和對(duì)照組間有顯著差異。
　　 5.對(duì)T2DM組內(nèi)不同基因型的臨床特征，使用二項(xiàng)Logistic回歸，經(jīng)過(guò)性別、年齡和體重指數(shù)校正后分析發(fā)現(xiàn)，rs2237892位點(diǎn)CC基因型和CT+TT基因型相比，收縮壓(P=0.015)以及糖尿病合并高

9、血壓(P=0.04)和糖尿病大血管病變(P=0.05)在兩者間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 6.線粒體DNAT16189C和一些多態(tài)性位點(diǎn)(249A-del，12705T，16223T,16298C,16519C)構(gòu)成的5組單體型在第一組病例-對(duì)照組人群中顯示與T2DM顯著相關(guān)，其中249A-del呈負(fù)相關(guān)，相反，另外4組則呈正相關(guān)。
　　 7.第一組和第二組研究對(duì)象綜合后再次分析線粒體DNA中5組單體型(16189C和24

10、9A-del，12705T，16223T，16298C，16519C)與T2DM的關(guān)聯(lián)，結(jié)果顯示除16189C/16298C單體型在T2DM組和對(duì)照組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，另外4組差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)論：
　　 1.本研究在浙江溫州地區(qū)漢族人群中進(jìn)一步證實(shí)了CDKAL1基因rs7756992位點(diǎn)多態(tài)性與T2DM發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增加的關(guān)聯(lián);另外，該位點(diǎn)可能對(duì)T2DM血糖調(diào)節(jié)機(jī)制有一定影響，這還需要進(jìn)一步研究。