基于ISSR分子標(biāo)記的南方紅豆杉的遺傳特征研究及其SSR文庫(kù)的構(gòu)建.pdf

1、南方紅豆杉(Taxus chinensis var. mairei)又稱美麗紅豆杉,為我國(guó)特有的第三紀(jì)孑遺植物,是紅豆杉屬(Taxus)中分布最廣的植物種類之一。由于其含有抗癌活性成分紫杉醇,使其成為重要的藥用植物。主要分布于長(zhǎng)江流域以南各省區(qū)、南嶺山脈山區(qū)以及河南、陜西、甘肅等省的山地或溪谷。本研究主要采用核基因簡(jiǎn)單重復(fù)序列區(qū)間(ISSR)分子標(biāo)記,探討南方紅豆杉的遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性,并構(gòu)建了 SSR文庫(kù),旨在為制定南方紅豆杉遺傳保

2、育策略并實(shí)施有效保護(hù)和利用提供理論依據(jù)。主要研究結(jié)果如下:
　　1.南方紅豆杉ISSR分析結(jié)果
　　通過(guò)對(duì)11個(gè)省市20個(gè)南方紅豆杉種群的320個(gè)個(gè)體的ISSR標(biāo)記檢測(cè),結(jié)果顯示:南方紅豆杉在物種水平上:PPL為91.20％,Nei’s基因多樣性為0.3331, Shannon′s信息指數(shù)為0.4954,在種群水平上:PPL為62.36%,Nei’s基因多樣性為0.2189,Shannon′s信息指數(shù)為0.3264,種群和物

3、種水平上均具有較高的遺傳多樣性,且種群水平遺傳多樣性低于物種總遺傳多樣性。同時(shí),20個(gè)種群的物種總基因多樣性(Ht)為0.3331,其中種群內(nèi)平均遺傳變異(Hs)為0.2189,Nei′s基因分化系數(shù)(Gst)為0.3428,即表明總的遺傳變異中有34.28%來(lái)自于種群間,65.72%來(lái)自種群內(nèi),種群內(nèi)的分化明顯。分析認(rèn)為:南方紅豆杉的遺傳多樣性主要分布于種群內(nèi),原因可能與其生活史類型和交配系統(tǒng)有關(guān)。
　　根據(jù)Nei′s遺傳距離進(jìn)

4、行UPGMA聚類分析,將南方紅豆杉20個(gè)種群分成了兩大支,該結(jié)果與先前研究的結(jié)論有差異。從整體和分組上對(duì)遺傳距離和地理距離的相關(guān)性進(jìn)行 Mantel檢測(cè)發(fā)現(xiàn):在整體物種水平上,遺傳分化和地理距離呈中度相關(guān)(r2=0.2247, P<0.01);在分組水平上,第一組遺傳分化和地理距離呈中度相關(guān)(r2=0.1840, P<0.01);第二組遺傳分化和地理距離不具有相關(guān)性(r2=0.0955, P>0.05)。分析認(rèn)為,南方紅豆杉的分布區(qū)地形

5、復(fù)雜,海拔差異大,分布地區(qū)有眾多高山峽谷,南方紅豆杉的基因流因此受到一定的阻礙,從而導(dǎo)致南方紅豆杉種群的遺傳分化和地理距離呈現(xiàn)中度相關(guān)性。
　　2.紅豆杉屬SSR引物在南方紅豆杉中的應(yīng)用
　　采用正交試驗(yàn)和單因素試驗(yàn),建立并優(yōu)化了南方紅豆杉SSR-PCR反應(yīng)體系。結(jié)果表明,南方紅豆杉SSR-PCR反應(yīng)的最優(yōu)結(jié)果為15μL反應(yīng)體系中模板 DNA為(50ng·μL-1)0.2μL, Mg2+為(25mM)1.2μL, dNTP為

6、(10mM)0.1μL,引物為(10μM)0.2μL,Taq聚合酶為(5U·μL-1)0.1μL。
　　將紅豆杉屬植物中已公布的30對(duì)具多態(tài)性的微衛(wèi)星位點(diǎn)的引物序列用于在南方紅豆杉物種中進(jìn)行轉(zhuǎn)移擴(kuò)增,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:30對(duì)引物中僅1對(duì)能擴(kuò)增出具有多態(tài)性的條帶。由此得出,紅豆杉屬其他物種的SSR引物在南方紅豆杉中的應(yīng)用效率極低,其引物跨物種擴(kuò)增不足以用于分析南方紅豆杉的遺傳多樣性。
　　3.南方紅豆杉微衛(wèi)星富集文庫(kù)的構(gòu)建

7、　　本研究共篩選出224個(gè)陽(yáng)性克隆,測(cè)序結(jié)果表明:其中189個(gè)克隆含有(CA)n、(AG)n等重復(fù)5次以上的微衛(wèi)星序列片段,其中完全型92個(gè),占48.7%;不完全型69個(gè),占36.5%;復(fù)合型28個(gè),占14.8%。南方紅豆杉微衛(wèi)星序列中的優(yōu)勢(shì)類型是(CA)n,此外還富集到了(GGC)n、(CACT)n、(GAGT)n、(ACAG)n等類型的微衛(wèi)星。同時(shí),南方紅豆杉基因組還含有許多小的不連續(xù)的(TG)n,散在分布在100~200 bp的范