氨胺酮誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激機(jī)制研究.pdf

1、目的:氯胺酮（ketamine）作為一種非競(jìng)爭(zhēng)性NMDA(N-methyl-D-aspartate)受體阻滯劑，可產(chǎn)生劑量相關(guān)的意識(shí)和感覺分離的麻醉狀態(tài)，廣泛用于成人和小兒麻醉。然而越來越多的研究結(jié)果顯示，全身麻醉藥氯胺酮可導(dǎo)致神經(jīng)損傷，引起神經(jīng)退行性疾病和長期的神經(jīng)認(rèn)知缺陷。因此對(duì)氯胺酮神經(jīng)毒性的研究引起人們的關(guān)注。
　　已有研究報(bào)道氯胺酮可導(dǎo)致嚙齒類、斑馬魚、非人類靈長類神經(jīng)細(xì)胞凋亡。細(xì)胞凋亡是細(xì)胞死亡的主要形式之一，有關(guān)細(xì)胞

2、凋亡的發(fā)生機(jī)制尚未充分闡明?，F(xiàn)在認(rèn)為有三條細(xì)胞信號(hào)通路參與凋亡的發(fā)生:即線粒體通路、死亡受體通路和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路。有研究報(bào)道氯胺酮可通過線粒體途徑導(dǎo)致體外培養(yǎng)的人胚胎干細(xì)胞發(fā)生凋亡，但氯胺酮是否可以通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（Endoplasmic reticulum stress，ERS）途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡還未明確。
　　已有研究表明，氧自由基、應(yīng)激激素和細(xì)胞因子等都可以影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能，導(dǎo)致未/錯(cuò)誤折疊蛋白堆積，激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。適度的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可

3、提高內(nèi)質(zhì)網(wǎng)處理未折疊或錯(cuò)誤折疊蛋白的能力，維持細(xì)胞的生存;如果應(yīng)激程度過強(qiáng)或時(shí)間過長，細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)態(tài)不能恢復(fù)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激最終將導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生凋亡。在一些神經(jīng)退行性疾病如帕金森病，阿爾茨海默病和亨廷頓病等的發(fā)病機(jī)制研究中已證實(shí)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可以引起神經(jīng)細(xì)胞的凋亡。葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（78-kDa glucose-regulated protein，GRP78），也被稱為免疫球蛋白重鏈結(jié)合蛋白(Immunoglobulin heavy chain

4、binding protein，Bip)，是未折疊蛋白反應(yīng)的主調(diào)控者。當(dāng)鈣超載、氧化應(yīng)激等因素導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中未折疊蛋白聚集時(shí)，GRP78/Bip釋放跨膜蛋白，引起ERS激活。因此，GRP78/Bip被視為ERS的標(biāo)志性蛋白。Caspase12是caspase家族成員，它僅產(chǎn)生于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。Caspase12僅在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)被活化，是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)凋亡途徑的關(guān)鍵蛋白酶。
　　基于以上研究背景，本實(shí)驗(yàn)中我們研究氯胺酮對(duì)PC12細(xì)胞的毒性作

5、用，觀察內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在氯胺酮誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷的過程中是否發(fā)揮了作用，為氯胺酮神經(jīng)毒性機(jī)制研究提供新的思路。
　　方法:
　　1 MTT實(shí)驗(yàn)觀察0.5、1、1.5、2、2.5 mM氯胺酮分別作用6、12、24 h對(duì)PC12細(xì)胞存活率的影響;20、30、40μM Salubrinal（內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑）單獨(dú)或與氯胺酮共同作用對(duì)PC12細(xì)胞存活率的影響。
　　2 Western blot方法檢測(cè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志分子GRP78

6、/Bip、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)凋亡分子Caspase12蛋白的表達(dá):1、1.5、2mM氯胺酮作用24 h對(duì)PC12細(xì)胞GRP78/Bip、Caspase12蛋白的影響;1.5mM氯胺酮作用6、12、24 h對(duì)PC12細(xì)胞GRP78/Bip、Caspase12蛋白的影響;加用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑Salubrinal共同作用于PC12細(xì)胞后對(duì)兩種蛋白的影響。
　　3為了明確氯胺酮是否導(dǎo)致了PC12細(xì)胞的凋亡，采用流式細(xì)胞術(shù)Annexin V-P

7、I雙標(biāo)染色法檢測(cè)PC12細(xì)胞凋亡率，并觀察內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑Salubrinal對(duì)氯胺酮所致PC12細(xì)胞凋亡的影響。
　　4數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示，用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，各組均數(shù)的比較行單因素方差分析（ANOVA），以p＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1 PC12細(xì)胞存活率的變化:與正常對(duì)照組相比，0.5mM氯胺酮作用于PC12細(xì)胞6h后細(xì)胞存活率沒有明顯變化(p＞0.0

8、5)，作用12、24 h后，PC12細(xì)胞存活率明顯降低(p＜0.05);1、1.5、2、2.5 mM氯胺酮作用于PC12細(xì)胞6、12、24 h后，PC12細(xì)胞存活率明顯降低(p＜0.05)，且呈濃度依賴性;20、30、40μM Salubrinal單獨(dú)作用于PC12細(xì)胞24 h對(duì)其存活率無明顯影響;30或40μM Salubrinal可抑制1.5 mM氯胺酮所致PC12細(xì)胞存活率的下降(p＜0.05)。
　　2內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志分子G

9、RP78/Bip蛋白表達(dá)的變化:與正常對(duì)照組相比，1.5、2mM氯胺酮作用于PC12細(xì)胞24 h后，GRP78/Bip蛋白表達(dá)明顯增高(p＜0.05 or p＜0.01)，呈濃度依賴性;1.5mM氯胺酮作用于PC12細(xì)胞12、24 h后，GRP78/Bip蛋白表達(dá)明顯增高(p＜0.05 or p＜0.01)，呈時(shí)間依賴性;30μM Salubrinal可抑制1.5 mM氯胺酮所致PC12細(xì)胞GRP78/Bip蛋白表達(dá)的增高。
　　

10、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)凋亡分子Caspase12蛋白表達(dá)的變化:與正常對(duì)照組相比，1.5、2mM氯胺酮作用于PC12細(xì)胞24 h后，Caspase12蛋白表達(dá)明顯增高(p＜0.05)，呈濃度依賴性;1.5mM氯胺酮作用于PC12細(xì)胞6、12、24 h后，Caspase12蛋白表達(dá)明顯增高(p＜0.05)，呈時(shí)間依賴性;30μM Salubrinal可抑制1.5 mM氯胺酮所致PC12細(xì)胞Caspase12蛋白表達(dá)的增高。
　　3 PC12

11、細(xì)胞凋亡率的變化:與對(duì)照組相比，1.5 mM氯胺酮作用24 h后PC12細(xì)胞總凋亡率明顯升高(p＜o(jì).05);30μM Salubrinal可抑制1.5 mM氯胺酮所致PC12細(xì)胞凋亡率的增高(p＜0.05);30μM Salubrinal單獨(dú)作用后細(xì)胞凋亡率較對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05)。
　　結(jié)論:
　　氯胺酮可誘導(dǎo)PC12細(xì)胞發(fā)生凋亡，且呈濃度依賴和時(shí)間依賴性;內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)了氯胺酮誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡